摘要

背景：在与人类相关的微生物群落中，微生物反硝化作用被认为并不重要。因此，对人类牙菌斑微生物生物膜群落的新陈代谢研究主要集中在有氧呼吸和碳水化合物的酸发酵上，尽管人们知道口腔栖息地经常暴露在毫摩尔浓度的硝酸盐(NO3-)中，而且牙菌斑中的细菌可以将NO3-还原成亚硝酸盐(NO2-)。

结果：我们利用微电极测量、15N同位素标记和反硝化基因的分子检测表明，牙菌斑介导了一氧化氮(NO)、一氧化二氮(N2O)和氮气(N2)的反硝化作用。口腔中N2O的体内积累率取决于牙菌斑的存在和唾液中NO3-的浓度。在有氧条件下，通过反硝化作用产生NO和N2O，并受牙菌斑pH值的调节。

总结：NO浓度的增加处于向人类宿主细胞传递NO信号的有效浓度范围内，因此可能对局部血流、神经之间的信号传递以及牙龈的炎症过程产生影响。这对了解牙周疾病具有特别重要的意义，因为NO在牙周疾病中发挥着关键作用，但牙龈细胞被认为是NO的唯一来源。更广泛地说，这项研究将人类相关微生物群落的反硝化作用确定为一个重要的代谢途径，由于同时形成了NO，为共生互动提供了基础。

背景

人体中自然存在着各种各样的微生物，它们的新陈代谢活动对人体生理和健康非常重要。对这些复杂群落的功能潜力和控制进行评估的大多数研究都依赖于：(i)单个分离物或富集物的特征描述，(ii)对被认为介导特定过程的微生物进行量化，或(iii)对特定身体区域进行元基因组分析。微生物生态学的既定方法允许在不同的实验条件下直接测量人体天然微生物样本的新陈代谢转换，如同位素标记底物的培养、特定化合物的染料探针与显微镜或电化学微传感器的结合，但这些方法鲜有报道。不过，有人提出人类体内存在不同的微生物途径，包括发酵、硫酸盐还原、甲烷生成和乙酰生成。令人惊讶的是，反硝化作用(硝酸盐(NO3-)或亚硝酸盐(NO2-)通过NO呼吸还原为N2O或N2被认为在与人类相关的微生物群落中微不足道，尽管NO3-和NO2-在人的口腔等身体各部位与微生物共同存在，且浓度很高。

反硝化作用由兼性厌氧微生物进行，与还原有机碳或还原无机化合物(如亚铁、硫化氢或氢)的氧化作用结合在一起。反硝化作用的还原顺序(NO3->NO2->NO>N2O>N2)由每一步的特异性周质酶和膜结合酶介导。在复杂的微生物样本中检测反硝化作用最重要的基因是：narG(NO3-还原酶)、nirS和nirK(NO2-还原酶)、qnorB或cnorB(NO还原酶)和nosZ(N2O还原酶)。反硝化细菌在纯培养物和复杂的微生物群落(如土壤、氮循环生物膜和不同无脊椎动物肠道内摄入的细菌)的代谢活动中释放NO或N2O作为中间产物。

值得注意的是，人类唾液中的NO3-浓度在毫摩尔范围内，因为膳食中的NO3-从肠道吸收进入血液后，会集中在唾液腺中。因此，牙菌斑中与人类相关的微生物生物膜群落以及覆盖在口腔表面其他的细菌都暴露在NO3-中。然而，对牙菌斑新陈代谢的研究主要集中在有氧呼吸和碳水化合物的酸发酵上。对大鼠舌头以及人类口腔中的牙齿和其他表面进行的实验表明，唾液中的NO3-可被口腔微生物转化为NO2-，这就解释了唾液中除了NO3-之外还存在NO2-的原因。在人的口腔中培养的空气中检测到NO，这导致了一种假设，即细菌衍生的唾液NO2-在口腔酸性微环境中化学还原为NO。由于无法在牙科生物膜中测量相关空间尺度的NO，因此其基本过程从未被直接证明。因此，其他研究者认为人类唾液中的NO2-是由牙龈细胞合成的NO的稳定氧化产物，用于调节牙龈免疫和血管系统。

由于可能形成NO，牙菌斑的氮代谢可能对牙齿健康很重要。牙菌斑会导致牙周病和龋齿，几乎影响到每一个人。牙周病是牙齿周围牙龈组织的一种炎症性疾病，如果在牙龈-牙菌斑界面产生的副产品是NO，那么牙菌斑的氮代谢可能会对牙周病产生特别大的影响。NO在牙周病中发挥着复杂的作用，但人们对它的了解并不多。低浓度的NO是一种重要的信号分子，可协调参与炎症过程的免疫系统细胞的功能。细菌脂多糖会刺激促炎细胞因子的产生，从而诱导某些免疫系统细胞产生高浓度且具有细胞毒性的NO。此外，炎症期间高浓度的NO会诱导中性粒细胞表达基质金属蛋白酶，从而介导软组织降解。

除了对牙齿健康的潜在重要性，口腔氮代谢对人体生理也很重要。口腔微生物形成的NO2-作为反硝化中间体导致NO2-在酸性胃中化学转化为NO，作为抗菌剂对抗病原菌并刺激胃血流。此外，NO2-被吸收到血浆中，成为缺氧条件下调节血管舒张的NO来源。目前还不清楚与口腔表面其他相比，人类牙菌斑中的微生物氮代谢是否重要。

在本研究中，我们假设牙菌斑是人类微生物反硝化的栖息地，推动唾液中的NO3-向反硝化中间产物NO和N2O以及最终产物N2的生物转化。我们直接使用微生物生态学方法，包括最近开发的NO微电极，来证明牙菌斑中反硝化过程中NO的原位形成，并证明NO的形成浓度对宿主组织的信号传递具有重要意义。此外，我们还希望通过将人类口腔中N2O的积累与唾液中NO3-/NO2-的浓度以及牙菌斑的存在相关联，来证明牙菌斑反硝化对形成反硝化中间产物的重要意义。