4讨论

多篇研究和综述论文表明，土霉菌菌丝的形态发育是影响洛伐他汀产量的最重要因素之一。其重要性首先与底物(尤其是氧气)的可用性有关，氧气进入菌丝团聚体的运输受到扩散的限制。由于真菌形态在土霉菌生产洛伐他汀过程中的重要性，MPEC被用于研究土霉菌生产洛伐他汀的过程。在这项工作中，MPEC被首次用于控制搅拌罐生物反应器中的真菌形态，该反应器同时以分批和连续补料模式运行。在此之前，这种方法仅用于摇瓶培养。

4.1形成洛伐他汀的最佳肉汤氧饱和度

目前的研究结果表明，在生产洛伐他汀的过程中，肉汤中的氧饱和度有一个最佳控制水平。此前，只有Lai等人研究了肉汤中氧饱和度在10%至40%范围内的影响；他们发现分批实验中的最佳值为20%。Casas Lopez等人和Rodriguez Porcel等人声称，肉汤中氧的饱和度越高(高达400%)，洛伐他汀的滴度越好，这就是他们使用富氧空气生产洛伐他汀的原因。与此相反，Bizukojc和Ledakowicz警告说，持续的高通气率可能会导致产生八酮副产物，如(+)-geodin。在目前的工作中，pO2=35%是连续分批补料工艺的最佳值，而40%(这些实验中pO2的最高控制水平)是分批工艺的最佳值。然而，3.1节所述实验中获得的最佳洛伐他汀滴度并不令人满意(即仍低于100mg LOV/l)，即使与我们之前在同一生物反应器中进行的pO2=20%的实验相比也是如此。

这里得到的最佳pO2水平与Lai等人和Bizukojc和Ledakowicz报告的不同，可能有两种解释：第一，培养基成分不同；第二，从颗粒大小、颗粒结构和肉汤中游离菌丝的数量来看，土霉菌的形态发生了变化。在土霉菌生产洛伐他汀的过程中，人们很少关注肉汤中的碳源浓度与提供足够的氧气使其氧化的关系。Lai等人使用的培养基(即更高浓度的乳糖和酵母提取物)比我们在本研究中使用的培养基浓度更高。在上述Casas Lopez等人和Rodriguez Porcel等人的研究中，使用了超过100g LAC/l的培养基和富氧空气，但作者并未显示乳糖浓度随时间的变化。只有Bizukojc和Gonciarz证明，可用氧气和碳底物之间的比例是高效生产洛伐他汀的关键因素。重要的是，不仅要避免出现图1G所示的分批培养现象，即乳糖缺乏导致洛伐他汀滴度下降，还要避免出现图1I所示的分批补料培养现象，即过量补料碳底物。

将pO2维持在过高的水平可能会导致洛伐他汀的浓度过低，这是因为所需的高通气速率和搅拌速度会对菌丝造成损害。在目前的工作中，pO2为40%的连续分批补料实验就属于这种情况，颗粒的崩解最终导致洛伐他汀滴度偏低。令人惊讶的是，文献中很少涉及机械应力问题，只有Rodriguez Porcel等人以有限的方式比较了土霉菌在搅拌罐生物反应器和浆柱中的生长情况。他们跟踪了这些类型的生物反应器中不同流体动力条件对颗粒直径、蓬松度和生物量浓度的影响，但没有提供有关洛伐他汀滴度的数据。

4.2颗粒内氧气浓度对洛伐他汀产量的影响

只有在设定的20%氧气水平下，才有可能保持纤毛虫的颗粒形态，并获得颗粒内氧气浓度的数据。以前在摇床中进行的实验中，只有直径小于1400μm的最小颗粒才能完全被氧气穿透。在这里的搅拌罐生物反应器中，即使在较小的颗粒(约1000μm)中也观察到了零氧气浓度，但只有在T01运行的紧密颗粒中才有。对于T02运行中较松散的颗粒，为避免颗粒中氧气浓度为零而设定的直径上限(约1400μm)大致得到了证实。Bizukojc和Gonciarz提出的最终结论，即通气性更好的颗粒可确保更高的洛伐他汀滴度，在生物反应器系统中也得到了证实。

颗粒内氧浓度水平还与活性生物量有关，而活性生物量又与特定真菌产生代谢物和酶的能力有关。以前，通过对产生洛伐他汀和葡萄糖淀粉酶的曲霉进行图像分析，量化了颗粒外层以及氧含量较高的层中的活性生物量。然而，在本实验中，尽管培养前制备方法的改变导致了颗粒大小和结构的改变，但洛伐他汀滴度的增加并没有预期的那么高。

综上4.1和4.2，可以说培养液的通气对洛伐他汀的生物合成非常重要，但真菌的形态是更重要的因素。Bizukojc和Ledakowicz以前曾在摇瓶中发现，颗粒的大小会影响洛伐他汀的生物合成。后来的研究和目前的实验(其中测量了颗粒内的氧浓度曲线)证明，颗粒大小对洛伐他汀生产的影响是由于氧扩散的阻力和颗粒内的氧含量造成的。

4.3形态工程改善洛伐他汀的生产

上一节表明，有必要控制生物反应器中菌丝的大小。我们可以采用传统的方法，如改变孢子数量或在生物反应器中诱导更高的剪切应力。第一种方法对土曲霉很有效。第二种方法在Casas Lopez等人的实验中并不成功，因为将叶轮转速从300转/分钟提高到800转/分钟会导致形成的被破坏颗粒变小，洛伐他汀滴度降低。如上所述，本文介绍的补料批次培养物中的洛伐他汀滴度降低是由于颗粒的破坏，尤其是在较高的pO2设置(40%)和长时间培养的情况下。

之前的MPEC摇瓶培养结果很有希望，因为当预培养液中滑石粉浓度为12g/l时，肉汤中的洛伐他汀浓度增加了一倍。在当前工作中进行的生物反应器研究中，分批系统中的洛伐他汀滴度也增加了一倍，但在甘油补料的连续补料式系统中，与对照运行相比，洛伐他汀滴度增加了3.5倍。分批补料培养是生产洛伐他汀的最佳系统，但这种长时间的培养过程很容易因长时间的机械应力而导致菌丝发生不希望看到的形态变化。Pawlak和Bizukojc的研究就证明了这一点。这些作者提出了各种补料方案，但没有控制真菌形态。因此，他们获得的洛伐他汀滴度低于100毫克LOV/l，这些滴度远远低于目前使用MPEC的工作中获得的滴度。因此，对于洛伐他汀的生物合成来说，细胞内的氧气浓度比培养液中的氧气浓度更重要。反过来，细胞内氧浓度又取决于土霉菌颗粒的大小和结构。通过MPEC等技术确保形成小颗粒的土霉菌非常重要，这种技术可在孢子聚集阶段提供适当的控制。试图通过传统的形态工程技术获得小颗粒是没有用的，例如增加搅拌以提供高剪切应力，从而破碎较大的颗粒。

5总结

可以得出四个重要结论。首先，培养液的氧饱和度是影响土霉菌生产洛伐他汀的一个重要因素。在某些过程中，提高氧饱和度可能会提高洛伐他汀滴度，除非维持高氧饱和度的方法会对真菌形态产生负面影响。其次，颗粒内氧气浓度是可能影响土霉菌培养过程中叶伐他汀滴度的另一个参数。如果氧气能更好地渗入颗粒，就能获得更高的洛伐他汀滴度。第三，颗粒内的氧气水平取决于土霉菌的形态，即颗粒的大小和结构。因此，菌丝的形态演变是影响洛伐他汀产量的最重要因素。第四，在搅拌槽生物反应器中由于剪切应力而形成的分散菌丝不能有效地生产洛伐他汀。只有使用微粒强化培养法，才能获得稳定的小微粒，从而显著提高洛伐他汀的滴度。因此，要想让土霉菌高效地进行洛伐他汀的生物合成，真菌的形态学、菌体的大小、菌丝的大小和菌体的大小都是至关重要的。因此，要想让土霉菌高效地进行洛伐他汀生物合成，必须在颗粒形成阶段对真菌形态进行控制。