2材料与方法

2.1菌种、培养基和培养条件

土曲霉ATCC 20542用于生产洛伐他汀。除非另有说明，预培养基的制备方法如下。将两个10天麦芽提取物斜面中的孢子洗到装有300毫升预培养基(含一小部分培养基)的烧瓶中。每升中约有109个孢子。然后将孢子悬浮液分成两个工作容积为150毫升的摇瓶。在30℃和110rpm的恒速旋转振荡器上预培养24小时。在选定的预培养物中加入规定量的碳酸钙(平均直径为10μm的微颗粒)，以诱导生长中的菌丝发生所需的形态变化。这些经过24小时培养的300毫升容积的预培养物被用作5.4升工作容积搅拌罐生物反应器的接种物(容积接种比为1:18)，该反应器以分批或连续分批补料模式运行。

在所有实验中，生物反应器中的生产培养基都含有作为初始碳源的20克LAC(乳糖)和作为氮源的4克YE(酵母提取物)。在预培养基中，乳糖浓度为10g LAC/l，酵母提取物浓度为8g YE/l。培养基的详细组成见其他文献。在所有连续分批补料实验中，生物反应器从48小时开始就以1.5毫升/小时的恒定补料速率加入甘油(500g GLY/l)溶液。所有生物反应器过程均在30℃温度下进行。此外，生物反应器中的pH值从运行24小时起一直控制在7.8，并使用碳酸氢钠和碳酸氢钾溶液。定期添加尽可能低剂量的消泡剂A(Sigma)以防止起泡，起泡在24至48小时内最为严重。实验分四批进行。

在第一批实验中，批次培养(实验T09和T10)的肉汤氧饱和度(pO2)设定为20%和40%，连续分批进行的培养(T01、T04和T06)的肉汤氧饱和度(pO2)设定为20%、35%和40%。采用级联控制，首先改变空气流速(从1.5升/分钟到8升/分钟)，然后改变搅拌速度(从175转/分钟到350转/分钟)。在某些实验中，只用空气流速控制pO2(见第3.3节)。

在第二批实验(T01和T02)中，采用了不同的批次生物反应器工艺预培养准备方法。在T01试验中，采用了上述标准方法。在T02实验中，只将一个斜面上的孢子洗到装有150毫升预培养基(含一小部分培养基)的烧瓶中。然后再加入150毫升无菌培养基。这样总共有300毫升，分装在两个摇瓶中。如上所述，摇瓶在30℃和110转/分的条件下培养。这一操作减少了孢子的数量，但没有改变体积接种比。

在第三批实验中，向标准预培养物中添加滑石微粒，浓度分别为9、12和15g/l(实验T14、T15和T16)。在进行这一系列实验的同时，还进行了不添加微颗粒的对照实验(实验T17)。

第四批实验系列包括连续分批进行的补料运行，其中使用了滑石微颗粒(12克/升)进行预培养(实验T21和T24-对照)。

2.2分析方法

用纸过滤器过滤从培养液中提取的样品，用蒸馏水洗涤菌丝，在105℃温度下烘干至恒重，以干重测定生物量(X)。使用液相色谱法测定过滤培养液中的乳糖、甘油(GLY)和洛伐他汀(LOV)浓度。分析前，样品还需经过0.2μm过滤器净化。使用Aquity RP18 1.7m(2×100mm)色谱柱在40℃温度下检测洛伐他汀。洗脱液(水-乙腈，均用0.1%甲酸酸化)流速为0.200ml/min，采用梯度洗脱：0.0-3.0min 60.0:40.0(v/v)3.0-7.0min 40.0:60.0(v/v)。在238纳米波长处检测洛伐他汀。乳糖和甘油在Aquity 1.7m(2.1×150mm)酰胺柱中测定，温度为35℃。流速为0.290ml/min。等度洗脱，分析物由蒸发光散射检测器检测。

在静态条件下，使用安装在计算机控制的电动微机械手(Unisense)上的克拉克型氧气微电极测量颗粒中的氧气浓度曲线。从生物反应器中取出颗粒后迅速进行测量。对测量氧气浓度曲线的颗粒进行数字拍照。然后，通过图像分析确定其直径。有关所有这些测量的详细信息，包括所用方法的优点和局限性，已在以前的文章中作了介绍。

氧气的对流传质系数(kLa)和氧气吸收率(OUR)是通过动态法测定的。