背景介绍：研究了中国浓香型白酒生产过程中发酵谷物和窖泥（微生物群落之间的协同作用及其对有机酸合成的影响。浓香型白酒是一种以高粱等淀粉质原料为主要成分，通过多物种微生物发酵制成的蒸馏酒。发酵过程中，发酵谷物和窖泥作为微生物生长的两个关键栖息地，其代谢分工尚不清楚。研究人员通过分析发酵过程中的环境变量、关键代谢物和微生物群落的变化，揭示这两个栖息地微生物群落的协同作用机制。采用的研究方法包括样本收集、环境变量和代谢物含量测定、DNA提取与定量实时PCR（qPCR）、Illumina MiSeq扩增子测序以及功能预测分析（PICRUSt）。样本收集自四川泸州老窖集团的泥窖，发酵周期为46天。研究发现，发酵谷物和窖泥在发酵过程中表现出不同的物理化学环境：发酵谷物呈酸性，乙醇含量高，而窖泥呈中性。乳酸主要在发酵谷物中积累，丁酸和己酸则主要在窖泥中产生。微生物群落结构分析显示，细菌在发酵过程中占主导地位，且发酵谷物和窖泥的细菌群落结构有显著差异。发酵谷物中的细菌群落多样性在发酵过程中显著下降，而窖泥中的细菌群落多样性相对稳定。乳酸菌（Lactobacillus）在发酵谷物中占主导地位，而窖泥中以梭菌纲（Clostridia）为主，特别是氢孢菌属（Hydrogenispora）。功能预测分析表明，参与乙酸和乳酸生物合成的酶主要富集在发酵谷物样本中，而窖泥的细菌群落显示出更大的丁酸和己酸合成潜力。体外模拟发酵实验进一步验证了Jiupei微生物群落在乙酸和乳酸生产中的作用，以及窖泥微生物群落将这些酸转化为丁酸和己酸的能力。本研究表明，发酵谷物和窖泥微生物群落之间存在协同合作，共同推动了浓香型白酒中关键风味化合物的形成。这一发现不仅增进了对浓香型白酒发酵过程中微生物群落相互作用的理解，而且为通过调节微生物群落来改善白酒风味和质量提供了科学依据。

Unisense微电极系统的应用

Unisense微电极系统被用于监测发酵过程中发酵谷物和窖泥的氧气含量变化。使用了OX-50型号的微电极传感器来测量氧气浓度。Unisense微电极系统被安装在三维显微操纵器上，并连接到微电极主机系统上，使用SensorTrace Pro软件进行控制。能够获得在发酵过程中实时监测氧气浓度的变化，更好地理解发酵过程中微生物的代谢活动和氧气利用情况。

实验结果

揭示了酒胚（发酵谷物）和窖泥在泥窖中由两个空间相连的微生物生境组成，其环境条件显著不同。宏基因组测序显示，酒胚（发酵谷物）和窖泥中微生物群落的结构在发酵过程中存在显著差异。乳酸菌在九皮的微生物群中占主导地位，而梭状芽胞杆菌是坑泥中的主要细菌，主要包括氢孢菌属、Sedimentibacter和Caproiciproducens。酒窖原位发酵和体外实验表明，乳酸和乙酸主要由九皮微生物群产生，栖息在窖泥中的微生物负责合成己酸和丁酸。这些是与浓郁风味白酒相关的四种关键有机酸。这项研究表明，酒胚（发酵谷物）和窖泥中微生物群落内的合作推动了白酒发酵过程中关键风味化合物的形成。

图1、人工奶酪样品中，NaCl或水与奶酪混合后的渗透压与水活性的关系。点表示观察值的平均值，误差条表示渗透压的10次重复实验和水活性的4次重复实验的两个标准差。

图2、13.5°C下奶酪成熟过程中，奶酪表面微观pH值的变化，A表示0.7厘米半径的奶酪表面凸起处，B表示4.3厘米半径的奶酪表面凹陷处。交叉点为观察值（每个日期n=5），虚线表示建模的变异性区域的2.5%和97.5%分位数。

图3、发酵谷物和窖泥微生物群落的β多样性。酒窖联盟的UPGMA聚类分析和PCoA分析。（A，C）细菌，（B，D）真菌

图4、白酒发酵窖中不同微生物栖息地之间的细菌流动。（A）直方图显示了发酵谷物和窖泥样品在发酵不同阶段的共享OTU的相对丰度。（B）跟踪酒平样品在不同发酵阶段共享OTU的Sankey图（矩形的高度与OTU的数量相关）。（C）发酵谷物和窖泥中主要OTU的相对丰度动态。

图5、观察到的奶酪表面微观水活性（aw）变异性，按表面和位置划分。连接的点表示一个奶酪表面的累计分布函数（cdf），描述表面内位置的变异性（s location）。连接点分布的离散性说明了奶酪间或表面间的变异性（s surface）。实线为一个表面的水活性中位数cdf，虚线显示了建模的表面间变异性区域的2.5%和97.5%分位数。

结论与展望

泥窖长期以来一直被用作中式浓香白酒发酵的厌氧生物反应器，其中淀粉原料（主要是高粱）被多物种微生物代谢成乙醇和各种风味化合物。发酵谷物和坑泥是泥窖中两个空间相关的微生物栖息地，但它们的代谢分工仍不清楚。在这里研究人员研究了发酵过程中发酵谷物和窖泥中环境变量（如温度、氧气、pH值）、关键代谢物（如乙醇、有机酸）和微生物群落的变化。酒胚（发酵谷物）（低pH值、高乙醇）和窖泥（中性pH值）为微生物生长提供了两个环境条件截然不同的栖息地。乳酸在发酵谷物中积累，而丁酸和己酸主要由栖息在窖泥中的微生物产生。

利用实时定量PCR的生物量分析表明，细菌在发酵过程中占微生物群落的主导地位，此外聚类和主坐标分析（PCoA）分析显示酒胚和窖泥的细菌群落存在显著差异。Unisense微电极系统被用于监测发酵过程中酒胚和窖泥的氧气含量变化，研究人员能够在白酒发酵过程中实时监测氧气浓度的变化，从而更好地理解发酵过程中微生物的代谢活动和氧气利用情况。酒胚中细菌群落多样性在发酵过程中显著降低，在窖泥中相对稳定。乳酸菌属在发酵谷物中菌群落中占主导地位，其相对丰度在发酵结束时达到98.0%。梭状芽胞杆菌（相对丰度：42.9-85.5%）是窖泥中最丰富的细菌，主要分布在氢孢菌属（5.3-68.4%）。发酵谷物和窖泥的真菌群落表现出相似的演替模式，其中Kazachstania、Aspergillus和Thermoascus是优势属。PICRUSt分析表明，参与乙酸和乳酸生物合成的酶主要富集在九平样品中，而窖泥中的细菌群落表现出更大的丁酸和己酸合成潜力。体外模拟发酵的分析进一步验证了九平微生物群在乙酸和乳酸生产中的作用，这些酸随后被坑泥微生物群代谢为丁酸和己酸。本研究工作证明了酒胚（发酵谷物）和坑泥微生物群落之间的协同合作，以形成浓郁风味的白酒的代表性风味。