研究简介：吸引杀灭（AK）珠子是生物、微生物杀虫剂，作为合成土壤杀虫剂的替代品而开发。对于线虫控制，珠子基于藻酸钙/淀粉共封装产生二氧化碳（CO 2）的酵母酿酒酵母H205作为吸引成分，昆虫病原真菌Metarhizium brunneum CB15-III作为杀灭成分。然而，共培养过程中珠子内部的物理化学过程仍不清楚。本研究论文主要研究了共包封的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和绿僵菌（Metarhizium brunneum）在基于海藻酸钙的吸引和杀灭（Attract-and-Kill,AK）珠子中的相互作用机制，为开发高效、环保的生物杀虫剂提供科学依据。AK珠子作为一种替代传统化学杀虫剂的生物制剂，利用酿酒酵母产生的二氧化碳吸引害虫，同时绿僵菌在珠子表面形成孢子以感染并杀死害虫，尤其针对金针虫等土壤害虫具有显著的防控潜力。


研究中，通过微电极技术测量了不同配方珠子内部的氧气和pH值变化，发现共包封的AK珠子在2天内就形成了明显的氧气梯度，中心区域出现缺氧状态，表明两种微生物的代谢活动强烈。同时，AK珠子在3天内出现了显著的酸化现象，pH值下降至3.6，这与二氧化碳的最大生产力和绿僵菌孢子形成率的最大值相吻合，表明酸化可能与微生物的代谢活动密切相关。此外，研究还发现，降低酿酒酵母的负荷虽然减少了二氧化碳和孢子的总产量，但特定生产力（每1%酵母负荷的生产力）显著增加，这表明在较低的酵母负荷下，每单位酵母的代谢效率更高。通过调整酿酒酵母的负荷量，可以优化珠子的配方，提高其在实际应用中的效率和经济性。


研究结果表明，绿僵菌和酿酒酵母之间存在复杂的相互作用，既包括有益的协同作用，也存在资源竞争。这种相互作用对提高AK珠子的杀虫效果至关重要。未来的研究将进一步深入探索微生物在共包封系统中的相互作用机制，并在此基础上开发出更高效、更环保的生物杀虫剂配方，以满足农业可持续发展的需求。


Unisense微电极系统的应用


Unisense微电极被用于测量共包封的酿酒酵母和绿僵菌在基于海藻酸钙的吸引和杀灭（珠子内部的氧气和pH值变化。将微珠固定在定制的3天打印样品架中。使用数码显微镜目视确定微珠表面，随后通过手动作显微纵器（Unisense）插入电极。电极插入的距离略高于预期（20-50μm），然后缩回，以减轻刺穿微珠表面时在点点位置发生的压缩，并避免因在电极尖端前形成伪影和扩散屏障而引起的伪氧梯度。26起始深度（-500μm）、最大穿透深度（1200μm）、步长（100μm）、测量次数（3次）、测量时间（1 s）和测量间隔时间（5 s）在专用分析软件（SensorTrace Profiling，Unisense）中进行管理。该软件还记录并可视化了获得的信号。测量分三次重复进行，并按照制造商的建议，在两次重复之间用乙醇（96%）、盐酸（HCl，0.01 m）和水冲洗微电极。珠子内部的pH的使用了玻璃pH微电极，电极尖端直径为100微米。珠子同样被固定在样品架上，参考电极插入一个参考珠子中，两者通过铜线连接。使用手动双微操纵器同时插入pH电极和参考电极，测量从珠子表面到内部1600微米的pH值。通过精确测量珠子内部的氧气和pH值变化，揭示了珠子内部的微环境动态。这些数据帮助研究人员理解微生物的代谢活动和相互作用，还为优化珠子配方、提高杀虫效果提供了科学依据。


实验结果


测量结果显示，共包封后2天已经出现了陡峭的氧梯度，内部存在低氧区。包封酿酒酵母或布伦纽分枝杆菌已经将平均pH值分别从5.5降低到4.7和4.6。然而在第3天，共培养导致珠子的时间强酸化至pH值3.6，这遵循最大CO2生产率并与最大分生孢子速率相吻合。降低酵母载量将总CO2生产率降低到一半，分生孢子产量降低93%，而归一化为1%酵母载量的特定生产率分别增加了8倍和3倍，第3天是一个例外。研究表明，M.brunneum和S.cerevisiae之间存在普遍有益的相互作用，但也表明了对资源的竞争。这些发现将有助于开发具有最高效率的创新联合配方，以节省施用率和成本。

图1、通过氧微电极在正面（A）、侧面（B）和背面（C）视图中用于氧气测量的样品架的描述。在穿刺部位，发生了珠子的压缩，特别是对于不含淀粉的珠子（C），微电极执行了进/出运动。

图2、实验装置（A）和用于pH测量的样品架在带有pH微电极和外部参比电极（B）的微珠内。测量珠和参比珠通过连接到样品架的铜线（B，白色箭头）电接触。测量过程中的视角（C）。

图3、绿僵菌（MB）和酿酒酵母（SC）的共包封导致海藻酸钙/淀粉珠（A）内的氧分布呈陡峭梯度，并显着降低总氧水平（B）。在25°C的潮湿滤纸上孵育2天后，使用Clark型氧微电极测量整个珠子半径内不同成分的湿珠内的氧（平均值±标准偏差，n=3）。氧水平归一化为珠子表面的氧水平。

图4、绿僵菌（MB）和酿酒酵母（SC）的共包封导致AK珠中pH值的时空降低。在25°C湿滤纸上孵育0-16天后，在整个微珠半径（0–1600μm）内测量不同成分的湿珠内的pH值。

图5、二氧化碳（CO 2）生产率（A）和分生孢子形成（B）在每个给定时间点通过减少藻酸盐/淀粉珠中与绿僵菌共包埋中的酿酒酵母（酵母）载量而显著降低。珠子要么在室温下在通风玻璃瓶中的水琼脂上培养，然后用CO 2计进行测量，要么在23°C的密封培养皿中孵育，并使用细胞计数室测定分生孢子浓度。


结论与展望


吸引杀灭（AK）珠子是生物、微生物杀虫剂，作为合成土壤杀虫剂的替代品而开发。对于线虫控制，珠子基于藻酸钙/淀粉共封装产生二氧化碳（CO 2）的酵母酿酒酵母H205作为吸引成分，昆虫病原真菌Metarhizium brunneum CB15-III作为杀灭成分。然而共培养过程中珠子内部的物理化学过程仍不清楚。本研究揭示了用微电极测量的AK珠子内氧气和pH值的时空条件，并描述了酿酒酵母对CO2和分生孢子形成的影响。共包埋的MB和SC存在协同作用，即使两种真菌以标准酵母负荷竞争AK珠子中的资源。


Unisense微电极被用于测量共包封的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和绿僵菌（Metarhizium brunneum）在基于藻酸钙的吸引和杀灭（Attract-and-Kill,AK）珠子内部的氧气和pH值变化。获得的数据不仅帮助研究人员理解微生物的代谢活动和相互作用，还为优化珠子配方、提高杀虫效果提供了科学依据。研究结果表明，M.brunneum和S.cerevisiae之间存在普遍有益的相互作用，但也表明了对资源的竞争。这些发现将有助于开发具有最大功效的具有成本效益的生物共制剂，从而促进害虫管理。这些发现将有助于开发具有最高效率的创新联合配方，以节省施用率和成本。未来需进一步研究微生物之间的相互作用机制，例如在单细胞水平上使用微流控培养系统，以更深入地理解这些复杂的关系。识别珠子内部的物理化学限制或协同作用对真菌生长和杀虫效果的影响，以进一步优化生物杀虫剂的配方。