图2、氧化亚氮微电极系统的工作流程示意图。（A）建立Unisense 氧化亚氮微电极。（B）氧化亚氮微电极系统的启动，包括预激活、极化、使用N2O标准溶液进行校准，并构建线性回归以计算每个实验的样品浓度。（C）样品测量需要10 min，其中前5 min用于平衡，后5 min的信号取平均值以获得数据。（D）每次使用10次连续稀释浓度的N2O标准溶液和0μM的水构建线性回归。对于低于0.1μM的浓度（根据制造商的说明的最低检测限），将处理为0μM。

图3、定量慢生根瘤菌属产生的N2O伴/不伴Calonectria ilicicola。（A）在提供100μM KNO3的酵母甘露醇肉汤（YMB）中进行体内测试。（B）在提供500μM KNO的YMB中进行体内测试。仅对缺乏nosZ基因的日本慢生根瘤菌检测不到N2O，而未检测到携带nosZ基因的慢生根瘤菌。

图4、评估Calonectria ilicicola对结节健康和N2O含量的影响。Bd：慢生根瘤菌，Bj：慢生型大豆根瘤菌，Ci：Calonectria ilicicola.（A）C.ilicicola对大豆根腐病的影响。（B）C.ilicicola对根瘤大小的影响。（C）C.ilicicola对根瘤重量的影响。（D）C.ilicicola对根瘤数量的影响。（E）C.ilicicola对根瘤中N2O含量的影响。（F）C.ilicicola对酵母甘露醇肉汤（YMB）中根瘤和Bd中nosZ相对表达的影响

图5、Bradyrhizobium属特异性引物和四种物种特异性引物的开发。（A）凝胶电泳，交叉验证Bd、Bj、Be和Bl特异性PCR产物的特异性。（B）凝胶电泳以交叉验证Bradyrhizobium属特异性PCR产物的特异性。（C）qPCR反应中Bd特异性引物的熔解峰。（D）qPCR反应中Be特异性引物的熔解峰。（E）qPCR反应中Bj特异性引物的熔解峰。（F）qPCR反应中Bl特异性引物的熔解峰。（G）qPCR反应中Bradyrhizobium属特异性引物的熔解峰。


结论与展望


氧化亚氮（N2O）的产生是实现农业净零排放的重大挑战，这主要是由于对氮肥的依赖。尽管氮肥满足了生产富含蛋白质种子的高氮需求，但大豆（Glycine max）也能与根瘤菌形成根瘤以促进生物固氮。然而，某些根瘤菌可以进行反硝化作用，这一过程将NO₃⁻还原为N₂。如果反硝化的最后一步由一氧化二氮还原酶（由nosZ基因编码）介导——被破坏，N2O将被产生，而不是N2。


研究表明由含有nosZ基因的Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110形成的根瘤比由缺乏nosZ基因的Bradyrhizobium japonicum USDA6形成的根瘤产生更少的水溶性N2O，突显了nosZ基因在减少根瘤中N2O含量中的关键作用。


此外，接种真菌病原体Calonectria ilicicola会减少B.diazoefficiens的根瘤生物量和nosZ基因表达，导致根瘤中N₂O含量增加。然而当大豆根瘤中存在nosZ基因时，C.ilicicola引起的N₂O含量增加变得无关紧要。因此研究人员进行了田间调查以揭示nosZ基因的区域分布情况。Unisense 氧化亚氮微电极在本研究中发挥了关键用，通过高精度的N2O检测，为研究根瘤菌和土壤真菌病原体对大豆根瘤中N2O含量的影响提供了可靠的数据支持。


该设备的高灵敏度和精确度使得研究人员能够准确评估不同条件下N2O的产生情况，为理解农业生态系统中N2O的产生机制提供了重要的实验依据。这些发现强调了使用含有nosZ基因的根瘤菌菌株以促进可持续大豆生产的重要性，这比控制土传病原体如C.ilicicola更为重要，以减少N2O的产生，同时综合考虑细菌和真菌的影响将支持可持续农业实践的净零目标。