研究简介:反硝化作用在全球碳氮循环中占据重要地位，但不完全反硝化产生的N₂O会加剧气候变暖。在许多河口、沿海地区及海洋缺氧区域，硫循环对生物地球化学过程影响重大，其中硫化物会抑制反硝化活性并增加N₂O排放。以往观点认为，化能自养反硝化菌主导硫化合物氧化和硫化物解毒过程，然而近期研究发现部分化能异养反硝化菌（F-SOHDs）也具备硫化物氧化能力，但其在自然生态系统中的存在和生态作用尚不明确。本研究以松花江口水体和沉积物为研究对象，综合运用微宇宙培养、DNA稳定同位素探测（DNA-SIP）、定量PCR、宏基因组测序等技术，深入探究异养反硝化菌对硫化物的响应。研究发现，硫化物和有机物均可促进河口沉积物中硝酸盐的还原。DNA-SIP实验显示，Thauera、Azoarcus和Pseudomonas等异养反硝化菌参与了硫氧化和反硝化过程。宏基因组测序结果表明，部分微生物具备近完整的反硝化或DNRA途径，同时编码多种硫氧化酶。长期富集培养实验证实，F-SOHDs在有无硫化物的环境下均能生长并进行反硝化，且有机物对其硫氧化作用至关重要。此外F-SOHDs能高效消耗硫化物，将其作为替代电子供体促进完全反硝化，能够显著降低N₂O排放。本研究首次揭示了河口沉积物中F-SOHDs的存在，明确了其在硫氧化和反硝化过程中的重要作用，为理解微生物群落的生态功能提供了新视角，对调控碳、氮、硫循环以及减少N₂O排放具有重要意义，同时也为后续相关研究和应用奠定了基础。


Unisense微呼吸系统的应用


使用Unisense SULF-100和N₂O-100型微电极传感器，对不同培养物实验过程中液相的可溶性H₂S和N₂O浓度进行连续监测。在探究F-SOHDs对硫和氮循环影响的实验中，通过自动采样针和这两个预校准的微传感器，持续收集相关浓度数据。这些实时监测的数据，通过Unisense微传感器获取的H₂S和N₂O浓度数据，结合其他实验数据，能够计算出多个重要参数。利用这些数据，可以深入分析F-SOHDs在不同环境条件下的代谢过程，以及对硫和氮循环的具体贡献。计算出硫化物作为电子供体对完全反硝化的贡献比例，评估反硝化过程的完成程度，全面地了解F-SOHDs在生态系统中的作用机制。


实验结果


本研究揭示了一类多功能的异养反硝化细菌（在河口沉积物中的存在及其生态功能。这些细菌能够通过化学自养异养代谢将硫氧化与反硝化耦合，从而在硫化物存在的情况下生存并减少一氧化二氮（N2O）的排放。研究发现异养反硝化细菌（如Azoarcus和Pseudomonas）能够利用硫化物作为电子供体进行反硝化。这些细菌不仅能够氧化硫化物以解毒，还能通过这一过程获取能量，支持其生长和反硝化功能。这种能力使它们能够在富含硫化物的环境中生存，同时减少N2O的排放。F-SOHDs在硫化物存在的情况下表现出显著的生态优势。它们能够在硫化物和有机物的共同作用下加速反硝化过程，并显著减少N2O的排放。此外，这些细菌在硫化物存在和缺失的条件下均能生存，显示出较强的环境适应能力。F-SOHDs通过氧化硫化物，不仅减少了硫化物的毒性，还为反硝化过程提供了额外的电子供体，从而促进了完整的反硝化过程，减少了温室气体N2O的排放。

图1、河口沉积物的功能特性和注入反应动力学。a)河口沉积物微观世界中硫酸盐还原活性的评估（三个生物重复）。沉积物与缺氧的上覆水一起孵育。b)使用qPCR定量沉积物中与硫酸盐还原、硫化物氧化和硝酸盐还原相关的生物标志物的基因拷贝。硝酸盐还原包括反硝化和异化硝酸盐还原为铵（DNRA）过程。c)通过提供硝酸盐和硫化物促进硝酸盐减少（三次生物学重复）。蓝色圆圈表示补充硫化物时的消耗量。未添加硫化物的孵育中的硫化物水平低于检测水平。d)通过提供硝酸盐和有机物（OM）促进硝酸盐减少（3次生物重复）。

图2、DNA稳定同位素探测（DNA-SIP）揭示的河口沉积物中的碳、氮和硫循环。DNA-SIP图谱显示通过qPCR确定的群落16S rRNA基因的浮力密度分布，用于用+C+N+S（a）和+C+N（b）处理的孵育。C表示提供无机（C）和有机（CO）碳。C和Co表示提供的无机碳（CO2加碳酸氢盐）和有机碳（葡萄糖、丙酸盐和乙酸盐），而N和S表示添加的硝酸盐（NO3−）和硫化物（S2−）。水平虚线表示重馏分和轻馏分之间的分界线。(c-g)重DNA组分的微生物群落组成，分别在+C+N+S、+C+S、+C+N、O、+C+N+S和+C微观世界中进行同位素标记。(h，i)未标记12 C和标记13 C孵育沿DNA密度梯度的sqr基因丰度。对于每个浮力密度分数，基因丰度被归一化为其拷贝数相对于总DNA拷贝数的百分比。有和没有同位素标记的峰基因丰度以青色和灰色突出显示。(j)三个13Co标记的微观世界中sqr基因总拷贝数的比较（双尾未配对学生t检验，来自三个技术重复的95%置信区间）。数据在SEM±表示为平均值。(k、l)未标记12 C和标记13 C的孵育沿DNA密度梯度的nirS基因丰度。m比较三个13Co标记的微观世界中nirS基因的总拷贝数。

图3、推定的F-SOHD的同位素和基因组知情富集和生理动力学。a)用于长期富集F-SOHD的定制策略。河口沉积物（简称START）用作接种。b，c)提供不同底物的ENR_C4富集的反应动力学。在Co+N和Co+N+S处理中，OM作为唯一的碳源，而C+N+S处理则依赖于无机碳的供应。在硝酸盐和亚硝酸盐耗尽63小时时提供溶解的硫化物和新鲜硝酸盐。d，e)在不同孵育条件下ENR_C4和ENR_U2细胞数的净增加率.

图4、F-SOHDs对生物地球化学循环和一氧化二氮（N2O）排放的影响。a）在富含OM和OM限制的条件下在不同实验室培养物中去除硫化物。在OM限制的条件下，ENR_U2和ENR_C4实验重复3次，硫化物的最终浓度始终低于检测限。b）来自硫化物（绿框）和OM（虚线）的电子对富含OM的培养物中反硝化过程的贡献。计算是在硝酸盐完全还原为二氮气的假设下进行的。c）来自OM限制的培养物中来自硫化物（绿框）和OM（虚线）的电子对反硝化作用的贡献。浅蓝色框表示反硝化作用的完成程度（即产生的电子百分比作为将硝酸盐完全还原为二氮所需的总电子的函数）。灰色框表示在没有OM的情况下反硝化的完成程度。d）在富含OM和OM限制的条件下，各种实验室培养物的OM代谢。OM消耗量的比较是在假设每个实验室培养物中的总电子供体足以支持完全反硝化e、f）富含OM的条件下，在存在或不存在硫化物的情况下，通过常规异养反硝化剂的富集培养物发射N2O和N2。g）N2O在富含OM和OM限制的条件下各种实验室培养物的排放。

图5、ENR_C4富集的动力学实验、细胞数量和微生物群落。a-i），硫氧化和有机物（OM）代谢伴随着硝酸盐还原的反应动力学。采用还原硫化物（-2）、溶解零价硫（0）、硫代硫酸盐（+2）和亚硫酸盐（+4）的不同价硫化合物来测试推测的硫支持的异养反硝化代谢。零价硫溶液是由溶解的多硫化物和脱氮锥虫25259产生的生物硫的混合物制备的。j）硫氧化代谢途径与异养反硝化耦合的完整性。红色勾号表示存在目标硫氧化能力。k）全长16S rRNA基因扩增子文库富集ENR_C4物种水平群落组成。


结论与展望


本论文研究了异养反硝化细菌在硫循环中的作用及其对温室气体排放的影响。异养反硝化细菌在碳和氮循环中发挥重要作用，但其对硫化物的耐受性较差，硫化物会抑制关键的反硝化酶反应，导致温室气体一氧化二氮（N2O）排放增加。研究团队通过微宇宙培养、DNA稳定同位素探针（DNA-SIP）和宏基因组学等方法，揭示了在河口沉积物中存在一群多功能的异养反硝化细菌，它们能够通过化学自养异养代谢将硫氧化与反硝化耦合，从而在富含硫化物的环境中生存，并显著减少N2O的排放。Unisense微电极系统中被用于连续监测实验体系中溶解态N2O和H2S的浓度变化。提供了高精度的N2O和H2S的实时监测数据，帮助了研究人员深入了解微生物群落的代谢过程，还为评估F-SOHDs在硫循环和温室气体排放调控中的作用提供了有力支持。因为这些数据对于揭示F-SOHDs的生态功能和潜在应用价值具有重要意义。揭示了异养反硝化细菌在硫循环中的隐藏贡献，还强调了它们在减少温室气体排放方面的潜在作用。这些发现为理解微生物群落中异养反硝化细菌的生态角色提供了新的视角，并为河口生态系统中硫、碳和氮循环的调控提供了重要的科学依据。