03.使用3DFG MEA进行细胞外和细胞内记录


我们按照先前报道的协议将诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）培养在3DFG MEA上。培养至少3天后，诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）获得自发且规律的电活动和机械收缩。3DFG MEA能够检测到2D心脏培养物的自发动作电位，信噪比约为27分贝。细胞外动作电位呈现出典型的负相和预期的Q相（Na+峰值）短于30毫秒。培养物的自发跳动频率约为每分钟60次，这与诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）的预期相符。正如先前的研究中所观察到的那样，在生理条件下，即在没有用于穿孔细胞膜的任何外部刺激的情况下，使用3DFG电极进行的细胞内动作电位记录不会发生。这表明尽管细胞与材料之间形成了紧密的黏附，但3DFG并不会自发地被心肌细胞内化。

图3电生理记录。（A）使用50微米电极的3DFG-MEA对诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）进行的代表性体外场电位（FP）记录。（B）激光照射后在50微米电极的3DFG-MEA上进行的代表性细胞内动作电位（AP）记录。（C）激光照射后细胞膜修复以及体外场电位信号重新出现时细胞内耦合的时间稳定性。右侧显示，用激光第二次刺激心肌细胞，产生新的孔隙并恢复细胞内AP记录。


用1064纳米超快脉冲激光以约1毫瓦的功率进行刺激，获得了细胞内AP，表明3DFG在激光脉冲照射下成功实现了细胞膜的光穿孔。激光刺激后获得的信号显示单相正峰，平均持续时间为206±28毫秒（以562个AP的50%振幅计算）。所获取的信号呈现出预期的心脏动作电位成分，即初始的急剧去极化阶段、轻微的复极化随后是较长的平台期以及最终的复极化阶段。细胞膜光穿孔可能归因于在超快脉冲激光照射期间，3DFG电极发射出热载流子。正如先前的研究中所报道的那样，这些热载流子处于热力学非平衡状态，能量很高，能够在与3DFG的界面处形成电子等离子体。如果局部热载流子密度超过某一阈值，电子等离子体的弛豫及其与水分子的碰撞会导致产生空化纳米气泡，从而局部破坏细胞膜。热电子与水分子的碰撞使其平均自由程限制在电解质-材料界面附近的几十纳米内。因此，光穿孔事件极其局限于激光激发的小区域（聚焦光斑直径约为2微米）。由于大部分光能都用于发射电子，整个过程不会影响局部温度（不产生热量）。


我们对分布在三个不同的人诱导多能干细胞心肌细胞培养物中的六个3DFG多电极阵列进行了细胞穿孔电生理实验（包括下一节中的实验）。3DFG实现局部光穿孔的成功率高达90%，与使用其他材料获得的先前结果一致。在3DFG多电极阵列上获取的细胞内动作电位幅度从几百微伏到5至6毫伏不等（平均细胞内动作电位约为3.56±1.96毫伏），信噪比高达43分贝。在我们的实验中，穿孔后可获得的最大幅度受到采集系统规格的限制。幅度高于6毫伏的细胞内动作电位有可能被记录下来，但放大器的饱和会失真这些信号，因此被丢弃。


平均而言，5微米的3DFG超微电极比50微米的微电极能获取到幅度更高的动作电位。这可归因于电极尺寸较小，导致光穿孔后密封电阻更高。为了突出3DFG-MEAs多通道细胞内记录的优势，我们在图S6中报告了一个在同一MEA上多个3DFG电极同时进行细胞内记录的示例。我们通过将MEA设备置于激光束下移动，并随后在同一样本上对多个电极进行光穿孔来获得这些测量值。由于所有光穿孔事件可在几秒内完成，而细胞内信号稳定几分钟，因此我们有充足的时间窗口，可同时从多个3DFG电极记录细胞内动作电位。对于心肌细胞，这些多点测量有助于绘制合胞体中信号传播的模式和速度，并通过增加分析细胞的数量来提高数据的可靠性。图S6还提供了所获取细胞内信号变化性的见解。我们可以观察到，信号的幅度因光穿孔后细胞内耦合程度的不同而有所差异。然而，各细胞中信号的形状及其持续时间仍保持相对稳定，其变化处于商业hiPSC-CM系列中典型的心脏类型变异性范围内。


与使用其他微电极材料时观察到的情况一样，在3DFG上的光穿孔过程是非侵入性的，因为可以在同一细胞上重复多次。在图3C所示的例子中，在首次光穿孔事件后几分钟内记录到的细胞内动作电位（AP）幅度约为1.5 mV。随着细胞膜的修复，信号幅度降低，细胞外场电位（FP）的形状再次变得明显。此时，我们在靠近首次激发的位置（距离首次激发几微米）再次激发细胞，以使完全细胞内动作电位的形状立即恢复。第二次穿孔后的信号幅度更高，达到约3 mV。然而，首次穿孔事件和第二次穿孔事件期间动作电位（AP）的持续时间并无差异。此外，在首次和第二次穿孔事件期间，培养物的跳动频率也保持不变。平均而言，多次光穿孔事件后记录的动作电位幅度更高，这是由于相对于总细胞-电极粘附面积，细胞内耦合面积增加所致。从长远来看，通过延长单次光穿孔事件后3DFG的细胞内耦合，也可能实现更长序列的细胞内动作电位记录。为实现这一目标，未来3DFG MEA的配置中可以采用文献中的各种策略。用作3DFG生长模板的突出纳米结构可通过促进细胞吞噬作用和诱导细胞膜弯曲来促进细胞内耦合，而细胞膜弯曲反过来又能激活局部内吞作用蛋白的募集。为了更好地评估3DFG结合光穿孔技术的细胞内记录性能，我们在表S1中报告了我们技术的主要特点以及其他在心肌细胞上测试的方法的特点。