随着高通量测序技术飞速发展,人们对微生物的认知也在逐渐深入。凌恩生物每天都会接到全国各类型微生物测序样本,上到山巅土壤,下至深海底泥;有老师研究植物根际和叶内微生物,也有老师关注动物昆虫肠道生理代谢的奥秘。为了得到能够研究的测序结果,规范标准的取样及送样是成功的前提。


在样本送测前,我们要注意以下几点:


1、取样使用的工具及容器必须经过灭菌处理;


2、取样后及时做好标记,记录取样相关信息;


3、样本送测前做好备份,防止意外发生丢失珍贵样本;


4、送测样本使用标准容器承装,在容器上标记清晰,送样不宜过多;


5、寄送时保持低温环境,建议使用干冰配送;


6、可使用凌恩微生态样本保真液,高品质样本是决定高品质研究成果的第一步。


常规土壤类样本取样方法-农田/森林/草原土壤等


(1)取样方法


按实验设计确定采样范围,取样器具需事先消毒灭菌处理。采样时应去除地表杂质,根据需要挖取相应深度(如5~20 cm)的土壤,置于冰上运至实验室。去除可见杂质,建议过2 mm无菌筛网。同一样方多点样本等量混合均匀后取5~10 g,保存无菌EP管中,进行核酸提取,或-80℃保存备用。若不能自行提取,可置于干冰寄送至公司。


注:建议戴一次性手套、口罩,进行严格取样和操作,尽可能减少人为的污染。



根际土壤样本取样方法-作物/蔬菜/草木根系等


(1)作物类(含草地等矮小植物)根际土壤取样方法


a.采集植物植株,去除根部大块土壤,置于冰上运输至实验室;


b.晃动根部,去除根部松散的土壤后,使用无菌刷子从根部收集残留土壤;


c.同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后,液氮速冻,置于-80℃冰箱保存。


(2)林木类根际土壤取样方法


a.采集地面下10-20 cm根际土壤,置于冰上运输至实验室;


b.过2-5 mm孔径无菌筛网;


c.同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后,液氮速冻,置于-80℃冰箱保存。


若不能自行提取,可置于干冰寄送至公司提取。


注:取样器具请事先消毒灭菌处理。若为真菌根际土壤,请务必尽可能去除菌丝体残留,减少对DNA/RNA提取的干扰。



植物表面微生物取样方法‍


(1)取样方法


依据实验设计,进行样方设置,每一样方进行多点取样,同一样方点等量混匀成一个样本。植物根部组织可以通过摇晃振荡或无菌刷子去除根表粘附土壤。


(2)样本前处理


将植物组织浸没于无菌PBS溶液,180rpm孵育20min;取出植物组织,再次加入无菌PBS溶液,180rpm孵育20min,取出植物组织,再次加入无菌PBS溶液,超声波洗涤10min(参数:160 W,30s/30s),最后取出植物组织至于-80度冰箱保存备用。


将三次洗涤液汇总,过0.2um滤膜(或12000g离心10min,收集沉淀),收集滤膜至于-80度冰箱保存。


植物内部微生物取样方法


(1)依据实验设计,进行样方设置,每一样方进行多点取样,同一样方点等量混匀成一个样本。


(2)对植物组织进行表面消毒操作或者使用上一步“植物表面微生物取样”中处理过的植物组织,液氮速冻后,研磨成粉,即可用来进行核酸的提取。


植物组织表面消毒具体操作如下:


无菌水洗涤30s,70%无菌乙醇洗涤2min,2,5%NaClO(含0.1%Tween 80)浸泡5min后转移至70%无菌乙醇浸泡30s,最后使用无菌水洗涤植物组织3次,即视为对植物组织表面进行无菌化。


表面无菌化的植物组织至于-80度冰箱保存备用或进行核酸提取。


植物根表面微生物取样方法


(1)将所研究的物体放在事先灭好的无菌容器当中;


(2)加入PBS缓冲液后进行振荡,使得微生物从物体表面充分的脱落并聚集在PBS缓冲液当中,震荡至少2h以上;


(3)直接提取PBS缓冲液中的微生物或者将缓冲液用滤膜过滤之后再进行DNA的提取。


PBS浓度和PH有要求:浓度是用1x的,PH值是7.4,一般买回来的PBS是10x的,建议稀释到1x。


注意:建议优先使用超声波洗涤。


空气样本微生物取样方法


使用空气抽滤机,使空气通过0.22μm滤膜,滤膜上有可见覆盖物(过滤时间越长,收集的空气中的灰尘越多,菌数量越多),收集完成后取下滤膜。滤膜置于冻存管中,液氮速冻,干冰寄送到实验室。


注意:由于样本特殊,微生物含量较少,建议多保管备份保存。


水体样本微生物取样方法


送样量:扩增子直径3-4cm滤膜1-2张;宏基因组直径3-4cm滤膜>=2张;


(1)研究目的进行确定水体的取样深度和范围;


(2)采样后进行滤膜过滤,选择合适孔径的滤膜,对于澄清水体或者略浑浊水体,选用0.22μm或者0.45μm的滤膜,取样体积大于5L;对于浑浊水体,建议先用大孔径的滤膜过滤一遍,再用小孔径的滤膜过滤;


(3)水体泥样的采集提供大于5g样本;


(4)用大体积干冰运输,且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。


注意:扩增子项目将2-3L水体过滤到1-2张滤膜(0.22或0.45um)后装入到离心管中;宏基因组项目将10L水体过滤到>=2张滤膜(0.22或0.45um)后装入到离心管中。




活性污泥与水体/地表沉积物类样本取样方法


(1)活性污泥


从活性污泥装置中取大于10 ml的悬浮污泥样本(约5-10 g沉降物),保存无菌EP管中,放入液氮或置于冰上,立即运至实验室进行核酸提取,或-80℃保存备用。


注:若液态污泥样本沉降物较少,可适当增加取样量。


(2)水体/地表沉积物


取距离水底/地表0-10 cm(具体按实验需要而定)的沉积物5~10 g,保存无菌取样袋或EP管中,置于冰上运送至实验室进行核酸提取,或-80℃保存备用。若不能自行提取,可置于干冰寄送至公司提取。