研究简介:反硝化作用是将硝酸盐转化为氮气的过程，对生态系统中的氮含量调节和生物圈的氮平衡有重要意义。反硝化不完全会导致温室气体N2O的产生，对气候变暖有贡献。在许多河口、沿海地区和海洋缺氧区域，硫循环对生物地球化学过程的调控起着关键作用，主要是因为硫酸盐作为最终电子受体的主导地位和硫化氢（H2S）从底质沉积物中的释放。硫化氢是一种有毒的螯合剂，能够强烈抑制依赖铜的金属酶，如亚硝酸盐还原酶（NirK）和N2O还原酶（NosZ），从而影响反硝化活性，可能导致N2O排放增加。异养反硝化细菌在全球碳和氮循环中发挥着关键作用。然而它们无法氧化硫化物，这使它们易受这种有毒分子的影响，硫化物会抑制关键的酶促反应，从而阻碍一氧化二氮（N₂O）的还原，导致温室气体排放增加。


本论文研究通过微观培养、同位素校正的DNA稳定同位素探针（DNA-SIP）和宏基因组学技术，对河口沉积物中一类异养反硝化细菌进行表征，发现它们通过化能异养代谢将硫氧化与反硝化耦合，从而得以生存。从富集培养物中进行的生态生理学实验表明，这些异养菌能够加速反硝化过程，并使用硫作为替代电子供体，在有机质丰富和贫乏的环境中显著减少N₂O排放。它们灵活的、非硫依赖的生理特性，可能使其在解毒硫化物、适应有机质波动以及减缓温室气体排放方面相较于传统异养反硝化细菌更具竞争优势。本研究揭示了这类异养反硝化细菌在微生物群落中的生态角色，并对硫循环和气候变化的调控提供了新的认识。


Unisense微电极分析系统的应用


Unisense微电极被用于监测实验过程中溶解态N₂O和H₂S的浓度变化。使用了两种类型的Unisense微电极：N₂O-100和SULF-100。uunisense微电极通过自动采样针连接到实验装置，能够连续记录液体相中的N₂O和H₂S浓度变化。这些数据被用于评估微生物群落的代谢活动和对不同处理的响应。通过分析微电极（N2O,H2S）记录的数据，发现F-SOHDs能够在硫化氢存在的情况下进行反硝化，减少N₂O的排放，硫化氢的氧化不仅能够解毒硫化氢，还能为反硝化提供额外的电子供体，从而促进完整的反硝化过程。


实验结果


硫化氢和有机物的添加都能促进河口沉积物中硝酸盐的还原。DNA-SIP实验表明异养生物（如Azoarcus和Pseudomonas）能够利用硫化氢作为电子供体进行反硝化。通过宏基因组测序，重建了63个高质量的微生物基因组，发现其中15个基因组代表了能够进行硫氧化和反硝化的异养生物。异养生物能够在硫化氢存在的情况下进行反硝化，减少了N2O的排放，这可能使它们在自然生态系统中具有竞争优势。F-SOHDs的存在和活动可能对硫循环和气候变化有重要影响，因为它们能够减少温室气体N2O的排放。

图1、作为兼性硫化物氧化异养反硝化细菌（F-SOHDs）的基因组的系统发育树、相对丰度和基因内容。a 63个代表性MAGs的系统发育位置。这些基因组来自Planctomycetota门，并选择作为外群。五个从公共数据库中获得的与F-SOHDs密切相关且具有相似推断功能的完整基因组作为参考基因组。b组装的MAGs在天然沉积物、短期同位素标记沉积物、DNA-SIP实验的重DNA分馏和富集培养物中的相对丰度。ENRC代表ENR_C4富集体的基因组。c碳、氮和硫代谢相关基因的有无情况。实心/空心圆圈表示目标路径的存在/缺失。碳固定列中的灰色圆圈表示DNA-SIP实验和丰度变化确认该基因组尽管存在rbcL基因，却无法固定碳。

图2、基于同位素和基因组信息的F-SOHDs的富集和生理反应动力学。a）长期富集F-SOHDs的定制策略。河口沉积物（称为START）作为接种物。考虑到F-SOHDs可以将反硝化与有机物氧化结合，是否使用硫化物作为附加电子供体，因此培养基在有硫化物和无硫化物的条件下交替进行，经过67个循环，历时460天。152天的分配培养槽操作用于预富集沉积物，得到较高的生物量。CMD表示提供无机碳、硝酸盐和硫化物的孵育条件。在每个稀释转移周期中，从HED孵育中获得的富集物被引入CMD孵育中，以测试化学自养潜力。对CMD条件做出积极反应的富集物被丢弃，而对其做出不利反应的则接种到下一个循环中。ENR代表最终的富集体（ENR_C4和ENR_U2），由F-SOHDs主导。b，c）在不同底物提供下，ENR_C4富集体的反应动力学。在Co+N和Co+N+S处理下，有机物作为唯一的碳源，而Ci+N+S处理则依赖无机碳提供。在63小时后，提供溶解的硫化物和新鲜的硝酸盐。d，e）在不同孵育条件下ENR_C4和ENR_U2细胞数量的净增加速率（双尾未配对Student t检验，95%置信区间）。

图3、F-SOHDs对生物地球化学循环和笑气（N2O）排放的影响。a）在OM丰富和OM有限条件下，不同实验培养物中的硫化物去除。HD是含有常规异养反硝化细菌的沉积物富集培养物，这些细菌不参与硫氧化。CD是硫氧化反硝化细菌Thiobacillus denitrificans ATCC 25259的纯培养物。ENR_U2和ENR_C4是两种F-SOHDs主导的富集物，分别具有不完全和完全的硫氧化能力。通过将HD培养物与CD T.denitrificans以3:1（CE_H，高比例）、1:1（CE_E，等比例）和1:3（CE_L，低比例）混合的方式建立了三种不同的微生物群落。在OM有限条件下，ENR_U2和ENR_C4实验重复三次，最终硫化物浓度始终低于检测限。b）在OM丰富培养物中，来自硫化物（绿色框）和OM（虚线）的电子对反硝化过程的贡献。在假设硝酸盐被完全还原为氮气的情况下进行计算。c）在OM有限培养物中，来自硫化物（绿色框）和OM（虚线）的电子对反硝化过程的贡献。浅蓝色框表示反硝化的完成程度（即将硝酸盐还原为氮气所需的电子的百分比）。灰色框表示在缺乏OM的情况下，反硝化的完成程度。d）在OM丰富和OM有限条件下，各实验培养物的OM代谢情况。在假设每个实验培养物中的电子供体足以支持完全反硝化的情况下，比较OM的消耗。e，f）在OM丰富条件下，常规异养反硝化细菌富集物在有无硫化物的情况下的N2O和N2排放。通过将氮原子归一化为初始硝酸盐浓度，显示出百分比。g在OM丰富和OM有限条件下，各实验培养物的N2O排放。


结论与展望


本文主要研究内容是关于多功能硝酸盐呼吸异养生物（F-SOHDs）在硫循环中的作用及其对环境的影响。论文研究的主要目的是揭示河口沉积物中异养反硝化生物在硫循环中的作用，特别是它们如何通过耦合硫氧化和反硝化来减少温室气体N2O的排放这些生物能够通过化学自养异养代谢将硫的氧化与反硝化作用耦合起来，从而在硫循环和氮循环中发挥重要作用，并对全球碳循环和气候变化产生影响。通过微宇宙培养、DNA稳定同位素探针（DNA-SIP）和宏基因组学等方法，揭示了这些异养生物在河口沉积物中的生态生理特性及其对环境的影响。unisense微电极可实时监测N2O和H2S的浓度变化，为评估微生物群落的代谢活动提供了关键数据。这些数据不仅支持了实验设计和数据分析，还帮助研究人员揭示了F-SOHDs在硫循环和氮循环中的独特生态功能，为理解微生物群落的代谢多样性和环境适应性提供了重要依据。文章不仅揭示了河口生态系统中一个之前未被充分认识的微生物群落的功能，还为理解全球碳、氮、硫循环提供了新的视角，并为减少温室气体排放提供了潜在的生物技术解决方案。