Dynamic in situ detection in iRhizo-Chip reveals diurnal fluctuations of Bacillus subtilis in the rhizosphere

iRhizo-Chip 中的动态原位检测揭示了根际枯草芽孢杆菌的昼夜波动

来源：PNAS 2024 Vol. 121 No. 40 e2408711121

 

1. 摘要核心内容

 

关键发现：

通过自主研发的微流控平台iRhizo-Chip，首次实现了水稻根际环境中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）生长的原位动态监测，发现其丰度存在显著的昼夜波动（白天增长至5,000–10,000 cells/mL，夜间降至2,000–3,000 cells/mL）。

驱动机制：

这种波动主要由根际溶解氧（DO）和pH的昼夜变化驱动（DO白天↑45%、夜间↓30%；pH白天↑5.3、夜间↓4.9），并通过体外控制实验验证（图5B, C）。

技术价值：

iRhizo-Chip 兼容多种原位检测技术（如荧光成像、平面光极），为研究根际多因子耦合过程提供了高时空分辨率工具。

 

 

2. 研究目的

 

核心问题：

解决传统方法无法在自然土壤环境中实时监测微生物动态的局限，探究枯草芽孢杆菌在根际的时空分布规律及其与环境因子的互作机制。

应用目标：

为优化益生菌定殖策略、提升生物防治效率提供理论依据，推动可持续农业发展。

 

3. 研究思路

 

平台开发：

设计iRhizo-Chip微流控装置（图1A-E），保留原位根际土壤（图1F），集成荧光探针、平面光极（PO）等技术，实现多参数同步监测。

 

动态监测：

使用GFP标记枯草芽孢杆菌，通过流式细胞术（图1G）和共聚焦显微镜（图2C）定量其昼夜丰度变化及空间分布（图2A-B）。

 

原位测量根际DO、pH、ROS（活性氧）、DOC（溶解性有机碳）的时空动态（图3A）。

机制验证：

通过线性回归分析环境因子与菌群生长的相关性（图3B）。

体外控制实验验证DO、pH、DOC、ROS对菌生长的独立影响（图5B-E）。

 

 

4. 测量数据及研究意义

关键数据来源与意义

测量指标 数据来源 研究意义

枯草芽孢杆菌丰度 流式细胞术（图1G）

荧光成像（图2C） 揭示菌群昼夜波动规律，证明根际微生物动态与植物生理节律同步。

DO/pH时空分布 平面光极（PO）（图4A）

Unisense微电极（附录图S4） 阐明环境因子的空间异质性（根尖DO/pH变化最显著），验证iRhizo-Chip数据可靠性。

ROS/DOC动态 荧光探针（H₂DCFDA）（图3A）

TOC分析仪 发现ROS与DO正相关（光照期↑）、DOC与菌生长负相关（夜间↑），揭示碳代谢与氧化应激的耦合作用。

菌群空间定殖模式 共聚焦成像（图2A-B）

附录图S7 显示菌群在根尖和伸长区富集，为根分泌物驱动的趋化行为提供证据。

 

5. 核心结论

 

昼夜波动机制：

枯草芽孢杆菌的生长受根际DO和pH昼夜振荡直接驱动（图5A）：

DO↑（光照期）→ 促进好氧生长（图5B）；

pH↑（5.3 vs 4.9）→ 显著提升菌增殖速率（图5C）。

次要因素作用：

DOC↑促进生长但根际夜间DOC积累与菌丰度负相关（图3B, 5D），暗示碳源竞争或代谢抑制；

高浓度ROS抑制生长（图5E），但生理范围内的ROS波动与菌丰度正相关。

技术突破：

iRhizo-Chip 首次实现自然根际土壤环境下的多参数原位联测，为研究微生物-植物-环境互作提供了范式工具。

 

6. 丹麦Unisense电极数据的详细解读

数据来源与方法

 

测量目标：

使用Unisense OXY25（DO）和pH-N微电极（丹麦Unisense公司），在自然土壤中每30分钟监测根际DO/pH动态（附录图S4），与iRhizo-Chip内PO数据对比。

对照设计：

将芯片内PO数据（图3A, 4A）与Unisense微电极的自然土壤数据同步分析，验证芯片模拟环境的真实性。

 

研究意义

 

验证平台可靠性：

Unisense电极作为土壤原位检测金标准，其数据与iRhizo-Chip的PO结果高度一致（附录图S4），证明iRhizo-Chip能准确模拟自然根际的DO/pH昼夜波动（如DO光照期↑15%），消除了微流控体系"脱离真实环境"的质疑。

揭示生态关联性：

Unisense数据证实自然根际存在强氧化-还原梯度（根尖DO最高，径向递减），与iRhizo-Chip中菌群的空间分布吻合（图4B）；

二者协同证明：植物光合节律（光照→根系释氧→DO↑/pH↑）是驱动微生物昼夜动态的核心生态链路。

技术互补性：

微电极提供点尺度高精度数据，而iRhizo-Chip实现二维时空成像，二者结合为根际多尺度过程研究提供完整方案。

 

总结

 

该研究通过创新性平台iRhizo-Chip，首次揭示了枯草芽孢杆菌在根际的昼夜生长波动受DO/pH直接调控，并利用Unisense微电极验证了人工芯片与自然土壤环境的一致性。这一发现深化了对根际微生态时间动态的理解，为设计"时间精准"的微生物接种策略（如白天施用益生菌）提供了理论支撑，同时推动了原位检测技术在土壤生态学中的应用边界。