Hydrogen production by a fully de novo enzyme （微生物产氢）通过完全从头酶制氢

来源：Dalton Trans., 2024, 53, 12905–12916

 

1. 论文摘要核心内容

 

研究对象：基于全新设计的三α螺旋蛋白（a3C）和钴基催化剂（钴肟，cobaloxime）构建的人工酶。

核心发现：该人工酶在中性水溶液中通过电化学、光化学和化学还原三种途径高效催化产氢（HER）。

创新点：首次证明小分子从头合成蛋白（de novo protein）可作为酶支架，用于开发生物启发的可持续产氢系统。

性能：产氢转化数（TON）达游离钴肟的80%，但速率为其40%，表明蛋白环境对催化动力学有调控作用。

 

2. 研究目的

 

解决关键挑战：传统钴肟催化剂需有机溶剂且水相稳定性差，限制其实际应用。

核心目标：设计水溶性、基于丰产元素（Co）的人工氢酶，实现中性水中高效产氢。

科学意义：探索人工蛋白支架在优化催化剂性能（稳定性、效率）中的作用。

 

3. 研究思路

 

分子设计：

通过非天然氨基酸（3-甲基吡啶-半胱氨酸）将钴肟共价锚定于a3C蛋白的32位点（图1）。

 

结构表征：

验证钴肟结合（质谱、UV-Vis）、蛋白折叠（圆二色谱）、钴价态（EPR）及电化学行为（循环伏安）。

功能测试：

在电化学、光化学（[Ru(bpy)₃]²⁺/抗坏血酸体系）和化学还原（[Eu(EGTA)]²⁻）条件下量化产氢性能。

机制分析：

对比游离钴肟与人工酶的活性差异，探讨蛋白微环境对催化动力学的影响。

 

4. 关键数据及研究意义

（1）结构表征数据

 

图2A（MALDI-ToF-MS）：

质谱峰证实钴肟成功连接至蛋白（m/z 7550.5 → 钴肟-蛋白复合物）。

意义：验证人工酶合成路径可行性。

 

图2B（圆二色谱）：

钴肟结合后α-螺旋含量降至50%（游离a3C为78%），但整体稳定性不变（ΔG~-4.3 kcal/mol）。

意义：蛋白结构可容忍金属催化剂嵌入，维持基本折叠。

图2C（EPR）：

Co(II)信号（g≈2.3）证实还原态钴中心存在，谱线差异表明蛋白环境限制溶剂配位。

意义：蛋白微环境调控钴的配位结构。

图2D（循环伏安）：

人工酶（3）与游离钴肟（2）还原电位相近（-0.90 V vs. NHE），但催化电流形状不同。

意义：蛋白支架保留电催化活性，但影响电子传递路径。

 

（2）产氢性能数据

 

光化学产氢（图3B-C & 表1）：

图3B（Unisense实时监测）：pH 6.2时，人工酶（3）TON=49（游离钴肟TON=62）。

图3C（GC终点检测）：pH 6时人工酶产氢量（41 μM H₂/μM催化剂）略高于游离钴肟（33 μM）。

表1（动力学参数）：pH 7时人工酶速率（2.5 μmol H₂/min/μmol cat）为游离催化剂的40%。

 

 

化学还原产氢（图4 & 表1）：

图4A-B：[Eu(EGTA)]²⁻还原下，人工酶初始速率显著低于游离钴肟（pH 7: 6.0 vs 2.5 μmol/min/μmol cat）。

意义：蛋白环境减缓电子/质子传递，但提升pH适应性（pH 6活性反超）。

 

 

5. 核心结论

 

成功构建人工氢酶：首次将钴肟整合至从头设计蛋白支架，实现中性水中多途径产氢。

蛋白支架的双重作用：

优势：提升催化剂水溶性及pH稳定性（pH 5-8保持活性），保护活性中心。

局限：空间位阻降低传质速率，导致产氢速率下降至游离催化剂的40%。

应用潜力：小分子从头合成蛋白（高效原子经济性）可作为可扩展生物启发催化剂的理想支架。

 

6. Unisense电极数据的详细解读与研究意义

数据来源

 

图3B：光催化产氢的实时动力学曲线（Unisense H₂微传感器监测）。

图4A-D：化学还原产氢的实时动力学曲线（同前）。

表1：基于Unisense数据的产氢速率（μmol H₂/min/μmol cat）和TON。

 

研究意义

 

高时空分辨率动力学解析：

Unisense电极实现秒级实时监测溶解H₂浓度，捕捉传统GC无法获得的初始速率信息（图4A-B斜率）。

例：光催化中人工酶（3）的产氢滞后现象（图3B），揭示蛋白环境导致电子传递延迟。

 

揭示pH依赖性的动态机制：

实时数据（表1）结合GC终点（图3C）发现：

pH 6时人工酶活性反超游离催化剂 → 蛋白微环境优化局部质子传递。

pH >7时速率下降 → 游离钴肟受限于Co-H形成能垒，而人工酶受蛋白刚性限制。

 

量化传质限制效应：

化学还原中（[Eu(EGTA)]²⁻过量），人工酶速率仅为游离催化剂40%（图4），直接证明：

蛋白口袋的位阻效应是速率限制主因（非电子转移能力）。

光催化中因还原剂浓度低，速率差异被掩盖（表1）。

 

指导后续设计：

数据表明：需在蛋白口袋引入质子中继基团（如Glu/Lys）或柔性结构域以平衡保护性与传质效率。

 

技术优势

 

无损原位监测：避免GC的取样误差，尤其适用于短寿命中间体研究。

高灵敏度：检测限达μM级H₂，精准量化低浓度催化活性。

 

总结

 

该研究通过整合结构生物学、电化学与实时传感技术，证实从头设计蛋白支架在可持续催化中的潜力。Unisense电极提供的动态动力学数是揭示蛋白微环境对传质影响的关键，为下一代人工酶设计提供了实验与理论基石。