Unraveling the interaction of co-encapsulated Saccharomyces cerevisiae and Metarhizium brunneum in calcium alginate-based attract-and-kill beads

揭示基于海藻酸钙的诱杀珠中共包埋酿酒酵母和布氏绿僵菌的相互作用

来源：Pest Manag Sci 2024; 80: 5131–5140   Pest Management Science published by John Wiley & Sons Ltd on behalf of Society of Chemical Industry

《害虫管理科学》，由John Wiley & Sons Ltd代表化学工业学会出版


摘要内容：

摘要介绍了诱杀珠（AK beads）作为生物杀虫剂的背景，其通过共包埋产二氧化碳（CO₂）的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae, SC）作为引诱成分和昆虫病原真菌布氏绿僵菌（Metarhizium brunneum, MB）作为杀灭成分来控制土壤害虫（如金针虫）。研究首次使用微电极测量了珠内氧气和pH的时空分布，并分析了SC负载量对CO₂产量和MB分生孢子形成的影响。结果表明，共培养导致珠内形成陡峭的氧梯度（中心缺氧）和暂时性强酸化（最低pH 3.6），且酸化与CO₂产量峰值及分生孢子形成高峰期重合。降低SC负载量虽减少了CO₂和分生孢子的总产量，但单位酵母负载的比生产率显著提高。结论指出SC与MB存在互利作用，但也存在资源竞争，优化配方可提高效率。


研究目的：

阐明SC与MB在钙-海藻酸酯/淀粉珠中共培养时的物理化学过程（氧气、pH分布）及相互作用机制，探究SC负载量对CO₂引诱效率和MB分生孢子杀灭效率的影响，为开发高效、低成本的生物杀虫剂配方提供依据。


研究思路：

制备不同组分的珠： 设计7种珠配方（表1、2、3），包括空白对照（仅海藻酸钙、海藻酸钙/淀粉）、单菌封装（SC或MB）及共封装（AK珠）。


微电极原位测量：


使用丹麦Unisense氧微电极（Clark型）测量不同配方珠在培养第2天和第6天的氧气空间分布（图3）。


使用Unisense pH玻璃微电极测量含淀粉配方珠在0、1、3、5、7、16天的pH时空变化（图4）。

评估真菌生产力：


改变AK珠中SC负载量（0%、1%、5%、10%、16.7%），测量其CO₂释放量随时间（0-14天）的变化（图5A）。

测量不同SC负载量下，MB在珠表面的分生孢子浓度随时间（0、3、7、10、14天）的变化（图5B）。


数据分析： 结合物理化学数据（O₂、pH）与生物活性数据（CO₂、孢子），解析SC与MB的相互作用及其对AK珠功效的影响。


测量的数据及其研究意义：

珠内氧气分布（图3）：


数据： 共封装（AK）珠在第2天即出现陡峭氧梯度，中心氧水平降至6.5%，形成缺氧区，此状态维持至第6天。单封装SC或MB珠也降低内部氧水平，但程度较轻（中心约60-83%）。添加淀粉对氧分布无显著影响。


研究意义： 首次原位揭示了AK珠内部存在严重且持续的氧气限制（缺氧），表明高代谢活性和/或氧扩散受限。这解释了共培养的高呼吸活性，并提示氧气可能成为限制因子，影响微生物生长和代谢（如酵母呼吸方式、真菌产孢）。

珠内pH时空变化（图4）：


数据： 共封装（AK）珠在第3天出现显著时空酸化，珠外围800μm区域pH降至3.6，随后恢复。单封装SC或MB珠也降低珠内pH（约4.6-4.7），但无梯度且波动小。酸化高峰期（第3天）与CO₂产量峰值及分生孢子形成高峰期重合。


研究意义： 揭示了共培养导致的独特且剧烈的局部酸化现象。酸化与关键生物活性（CO₂引诱和孢子杀灭）高峰同步，表明代谢活动（如酵母产酸、CO₂溶解成碳酸）强烈影响微环境。极端pH可能影响微生物活性、酶功能及相互作用。

不同SC负载下的CO₂生产力（图5A）：


数据： CO₂总产量随SC负载降低而显著减少（16.7%负载总产量最高）。但单位酵母负载的比CO₂生产率随负载降低而显著提高（1%负载时比生产率最高，达16.7%负载的8倍）。所有负载下CO₂生产率均在初期（<3天）最高后下降。


研究意义： 量化了SC负载对引诱效率（CO₂）的影响。高负载虽总量高，但资源利用率（比生产率）低，提示资源竞争或环境压力（如O₂限制、酸化）抑制了细胞活性。优化负载可提高成本效益。

不同SC负载下的分生孢子形成（图5B）：


数据： 分生孢子总产量和早期（0-3天）产孢速率均随SC负载降低而显著减少（16.7%负载最高）。但单位酵母负载的比产孢速率在低负载（<10%）下显著提高。标准负载（16.7%）下产孢无滞后期且速率峰值最高。


研究意义： 明确了SC负载对杀灭效率（孢子产量与速度）的关键作用。高负载促进MB快速大量产孢，可能是通过提供营养（死细胞）或触发产孢信号。低负载下比速率提高同样提示高负载存在抑制因素（竞争、压力）。产孢速度对田间快速起效至关重要。


使用丹麦Unisense电极测量数据的研究意义（详细解读）：

丹麦Unisense微电极（氧电极和pH电极）的应用是本研究的核心技术亮点，其测量数据具有以下重要研究意义：

首次原位揭示微环境时空动态： 传统方法只能测量珠整体或培养液的环境参数平均值。Unisense微电极具有高空间分辨率（微米级），能原位、无损地穿刺进入珠内部，连续测量不同深度（从表面到中心）的O₂和pH值。这首次绘制了AK珠内部的空间梯度（图3氧梯度，图4 pH梯度）和时间演变（图4 pH随时间变化），提供了前所未有的微观视角。


阐明共培养特有的物理化学胁迫： 数据清晰显示，只有SC和MB共封装（AK珠） 才会导致：


严重且持续的缺氧核心区（图3）： 中心O₂接近零，表明强烈的呼吸消耗远超O₂扩散补给能力。这解释了为何高酵母负载下比生产率低——缺氧可能迫使酵母进行低效的发酵代谢，并抑制MB生长。


剧烈的局部酸化（图4）： 外围区域pH骤降至3.6，远低于单菌培养。这直接关联到酵母的旺盛代谢（产酸、CO₂溶解）和共培养的高活性。极端pH可能抑制酶活性、营养吸收，甚至损伤细胞。

将微环境变化与生物活性峰值关联： pH测量数据（图4）显示，AK珠的强酸化（pH 3.6）发生在培养第3天。这与生物活性测量结果（图5）完美吻合：第3天是CO₂生产率峰值期（图5A）和分生孢子形成速率高峰期（图5B）。这种时空关联强烈表明，剧烈的代谢活动（由共培养驱动）是导致微环境酸化（pH）和耗氧（O₂）的主要原因，同时这些微环境变化也可能反馈调节（促进或抑制）生物活性（如酸化峰值与产孢高峰重合）。


为优化配方提供关键机制依据： 微电极数据揭示了高负载（标准16.7%）下存在的核心问题——资源（O₂）竞争和微环境（pH, O₂）胁迫。这直接解释了为何降低SC负载能大幅提高比生产率（单位酵母的CO₂和孢子产出，图5）：减轻了细胞密度，缓解了O₂限制和局部环境压力，使剩余细胞能更高效地工作。这为“减少应用量以节省成本”的优化策略提供了坚实的科学基础。



指导未来设计方向： 发现的O₂梯度（图3）表明珠中心区域可能因缺氧而利用率低下。这提示减小珠直径可能改善O₂扩散，提高整体效率。pH的时空动态也为理解微生物如何在受限空间内相互作用和适应提供了新见解。


结论：

物理化学过程： SC与MB共培养在AK珠内创造了独特的微环境：快速形成陡峭的氧梯度（中心缺氧）和暂时的强酸化（外围pH最低至3.6）。酸化高峰期与CO₂产量峰值及MB分生孢子形成速率高峰期重合（图3, 图4, 图5）。


SC负载的影响：


降低SC负载量显著减少了CO₂总产量和分生孢子总产量及早期产孢速率（图5A, B如下）。

但单位SC负载的比CO₂生产率和比分生孢子生产率在低负载（尤其1%）下显著提高（最高达8倍和3倍），表明高负载（16.7%）下存在资源竞争或环境压力导致的效率抑制（图5A, B如下）。

标准负载（16.7%）对快速启动分生孢子生产（无滞后期）至关重要（图5B如下）。

相互作用本质： SC和MB在AK珠中存在互利（协同）作用（如MB降解淀粉供SC利用，SC可能提供营养或信号促进MB产孢），但也存在对资源（如氧气）的竞争。高SC负载加剧了竞争和微环境胁迫（缺氧、酸化）。


应用价值： 理解这些相互作用和微环境限制有助于优化AK珠配方（如调整SC负载量、珠尺寸），在保证足够引诱（CO₂）和快速杀灭（孢子）效果的前提下，最大化资源利用效率（提高比生产率），从而降低应用剂量和成本。微电极技术是解析此类复杂共培养系统微环境的关键工具。