EPR Spin-Trapping for Monitoring Temporal Dynamics of Singlet Oxygen during Photoprotection in Photosynthesis  

EPR自旋捕获技术用于监测光合作用光保护过程中单线态氧的时间动态  

来源：Biochemistry 2024, 63, 1214-1224  

《生物化学》2024年第63卷第1214-1224页  

 

摘要内容：  

摘要提出了一种结合电子顺磁共振（EPR）自旋捕获和时间分辨荧光光谱的方法，用于实时监测植物类囊体膜在光保护过程中单线态氧（¹O₂）的动态变化。研究发现，在连续光照1小时期间，¹O₂的表观浓度先下降后上升。光照初期，¹O₂浓度的下降与非光化学淬灭（NPQ）激活导致的叶绿素荧光寿命缩短同步；而使用跨膜质子梯度解偶联剂尼日利亚菌素（nigericin）会延迟NPQ和¹O₂的调节。NPQ饱和后，无论是否处理，¹O₂*浓度均上升，表明NPQ在短期内（前10分钟）通过耗散过剩能量减轻光氧化压力。  

 

研究目的：  

明确光合作用光保护过程中单线态氧（¹O₂）的动态调控机制，验证NPQ（非光化学淬灭）对¹O₂产生的抑制作用，并开发一种能实时监测复杂生物系统中¹O₂*浓度变化的方法。  

 

研究思路：  

方法优化：先在染料系统（如玫瑰红RB和甲苯胺蓝TB）中验证EPR自旋捕获技术检测¹O₂*的可行性（图1B, 1C）。  

 

 

生物应用：将优化后的EPR方法应用于植物类囊体膜，结合时间分辨荧光光谱测量叶绿素荧光寿命（图6A-C），分析NPQ与¹O₂*的时间相关性。  

 

 

条件调控：通过添加解偶联剂（nigericin）破坏跨膜质子梯度，研究其对NPQ和¹O₂*动态的影响（图5C, 6E-F）。  

 

 

测量的数据及意义（标注对应图表）：  

EPR信号动力学（图2A, 3B, 4）：通过监测TEMPO自由基的生成和衰减，量化¹O₂*浓度变化，验证光照强度和氧气浓度对光敏化反应的影响。  

 

 

 

 

荧光寿命数据（图6A-C）：测量叶绿素荧光寿命变化，反映NPQ的激活程度（NPQ值计算为（τ_dark−τ(t)）/τ(t)）。  

氧气释放数据：使用丹麦Unisense电极（Oxy-NP探针）验证类囊体膜的放氧活性，确保实验体系的生理相关性。  

 

研究结论：  

NPQ在光照初期通过缩短叶绿素激发态寿命显著减少¹O₂*生成（前10分钟）。  

长时间光照后（>15分钟），抗氧化系统饱和导致¹O₂*浓度回升，表明NPQ的短期保护作用。  

跨膜质子梯度（ΔpH）是NPQ激活的关键因素，解偶联剂nigericin延迟了NPQ和¹O₂*的动态响应。  

 

丹麦Unisense电极数据的详细解读：  

使用Unisense Oxy-NP探针测量了类囊体膜的氧气释放活性，验证了分离膜的生理功能完整性。该数据确认了类囊体在实验条件下仍保持光驱动的水分解能力（即光系统II活性），排除了样本制备过程中可能导致的膜损伤对后续结果的干扰。这一测量为后续EPR和荧光实验提供了生物学有效性支持，确保观测到的¹O₂*动态变化真实反映光合膜的自然响应，而非人工假象。