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为了便于镜下观察,基于细胞培养的嗅球神经元是主要的实验对象之一。目前对离体嗅球神经元的电信号检测主要是膜片钳记录技术。随着微电子机械加工技术(MEMS)的发展,微电极阵列(microelectrode array,MEA)、光寻址电位传感器(light addressable potentiometric sensor,LAPS)和场效应晶体管(field effect transistor,FET)等微传感技术在生物信号检测中得到迅速发展和广泛应用。曾经将嗅球神经元培养在LAPS芯片上观察气味对僧帽细胞有无响应,作为研究嗅觉受体神经元对气味响应的实验对照。下面是操作步骤:
1.1器件准备
微电极阵列MEA的制作采用标准微电子制作工艺:5吋玻璃基底(厚度500μm)经过标准清洗后在表面磁控溅射一层厚度100~500Å的Cr或Ti-W薄膜作为中间层,然后再溅射厚度为2000~5000Å的Au薄膜形成电极层;溅射完成后,沉积一层聚酰亚胺或光刻胶作为绝缘层,并通过反应离子刻蚀技术(reactive ionetching,RIE)刻蚀暴露出金电极阵列图形。将器件固定在PCB座上,利用点焊技术将器件上的焊点与PCB板上的焊盘用金线连通。然后用生物相容性较好的环氧树脂覆盖焊丝,粘接测试腔,室温固化,得到如图1(a)所示的器件。
图1器件。(a)封装的器件;(b)电镀铂黑的MEA显微照片
为了降低热噪声,提高细胞胞外信号检测的信噪比,本实验对MEA金电极表面电镀铂黑颗粒,以增加电极的表面积,降低电极阻抗。电镀系统采用三电极系统与CHI660 C型电化学工作站,每个电极的电镀时间约45 s。最后得到的MEA显微如图1(b)所示,电极直径为30μm。
1.2细胞培养
嗅球细胞的培养与大多数神经元培养方法相似。将新生SD乳鼠(1~3 d)剪取鼠头,将其放入酒精中消毒1~2 min后,立即转入盛有磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)的无菌培养皿中。剪开头皮,拨开颅骨,暴露全脑。轻轻剥离两侧嗅球,放于另一无菌盛有PBS的培养皿中。轻轻剥去被膜,然后将嗅球剪成1 mm3左右的组织块,加入2 mL含10μg/L神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium)培养液中进行吹打,制成细胞悬液,接种在MEA表面。24 h后全量换液,48 h后滴加5-氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)以抑制胶质细胞的过度生长。每3 d换液一次。培养5~7 d后,可以将芯片取出进行观察和测试。
1.3染色处理
为了更加清楚地观察嗅球神经元的形态和生长状态,信号测试结束后对细胞进行染色处理。本实验采用瑞士染色法,染液包括Ⅰ和Ⅱ两组份,由碱性染料美蓝和酸性染料伊红分别配制而成。首先将细胞培养腔内的神经测试液吸干;然后滴加适量染液Ⅰ于培养腔内,保证溶液浸没细胞;1 min后将等量的染液Ⅱ滴加入培养腔,保证染液Ⅰ、Ⅱ均匀混合;大约5 min后用清水冲洗数遍;将培养腔内溶液吸干,置于显微镜下观察。
1.4信号采集与分析
利用多通道放大器(MEDl6,Multichannel systems,GmbH,德国),本实验可以实现16通道的同步记录,采样频率为10 kHz。
为了评估嗅球细胞网络传感器的检测能力,选用嗅球内兴奋性神经递质谷氨酸(glutamic acid,Glu)进行了实验研究[19],观察了Glu作用前后不同通道嗅球神经元的响应。Glu溶液由正常神经测试液配制而成,最终浓度为200μM。
信号的统计分析图和光栅图均通过Matlab软件完成。