研究简介:随着全球人口老龄化的增加，与年龄相关的骨缺陷问题，如骨质疏松和骨折愈合缓慢，已成为公共卫生领域的一个重要挑战。这些问题主要是由于骨组织再生能力的下降和微环境的恶化。在衰老的干细胞中，活性氧（ROS）的过度积累是细胞衰老的一个关键特征，它会导致氧化应激，损害蛋白质、脂质和DNA等细胞组分，从而阻碍老化骨骼的修复。为了解决这一问题，研究者们开发了一种创新的多层次ROS清除系统，该系统通过一种可注射的水凝胶实现，该水凝胶由PEG化聚甘油月桂酸酯（PEGS-NH2）和聚(γ-谷氨酸)（γ-PGA）组成，并含有载有雷帕霉素的聚（二硒代碳酸酯）纳米胶束（PSeR）。这种水凝胶设计用于响应老化微环境中的ROS水平，并具有高度敏感性，能够动态释放药物以清除衰老骨髓间充质干细胞（BMSCs）中积累的细胞内ROS。研究显示，PSeR水凝胶能够通过保护DNA复制过程中的氧化环境，有效调节骨间充质干细胞的抗氧化功能，并延缓细胞衰老。这有助于恢复细胞的自我更新能力，并增强老化骨骼修复的成骨能力。在体外和体内实验中，PSeR水凝胶都显示出了促进老化骨骼修复的潜力。此外，该水凝胶的开发还考虑了对ROS的多层次调节，包括减少细胞内外ROS的积累、提高抗氧化能力、通过ROS清除恢复衰老细胞的功能，以及适应老化骨骼再生的属性。这些特性使得PSeR水凝胶成为一种有前景的治疗手段，不仅能够促进老化骨骼的修复，还可能为其他退行性疾病的治疗提供新的思路。


本研究通过开发一种新型的ROS响应水凝胶，为老化骨骼的修复提供了一种新的治疗方法。这种方法通过调节ROS水平，改善了衰老细胞的微环境，从而有助于恢复其再生能力，为应对全球老龄化带来的健康挑战提供了科学依据和技术支持。


Unisense微电极测定系统的应用


Unisense微电极系统被用于测量血清的REDOX电位。REDOX电位是衡量氧化还原状态的指标，可以反映血清中氧化剂和还原剂之间的平衡。在老化和退行性疾病的研究中，了解血清的REDOX状态对于评估细胞的抗氧化能力和氧化应激水平是非常重要的。Unisense微电极系统包含微电极，其尖端直径为100微米，用于直接测量生物样品中的REDOX电位。


实验结果


开发了一种新型的多层次活性氧（ROS）调节水凝胶，用于恢复老化骨骼的修复能力。ROS的过度积累是衰老干细胞的特征，会导致氧化应激和微环境恶化，从而阻碍老化骨骼的修复。设计了一种可注射的PEG化聚甘油月桂酸酯（PEGS-NH2）和聚(γ-谷氨酸)（γ-PGA）水凝胶，该水凝胶包含载有雷帕霉素的聚（二硒代碳酸酯）纳米胶束（PSeR），用于敏感响应局部老化微环境中的ROS。PSeR水凝胶能够动态释放药物载载纳米胶束，以清除衰老骨髓间充质干细胞（BMSCs）中积累的细胞内ROS，并通过保护DNA复制来调节抗氧化功能，延缓细胞衰老。体外实验验证了水凝胶增强骨间充质干细胞自我更新能力和成骨能力的效果。在老年小鼠的体内实验中，PSeR水凝胶显著提高了老化骨骼缺陷的修复效率。

图1、具有ROS清除能力的SeR纳米胶束的制备和表征。a)mPEG-b-P(TMC-co-MSeSe)和SeR纳米胶束的合成路线。b)mPEG-b-P(TMC-co-MSeSe)的1 H NMR分析。c)mPEG-b-P(TMC-co-MSeSe)和100µm H 2 O 2氧化的mPEG-b-P(TMC-co-MSeSe)的77 Se NMR分析，氧化后，峰位置从290.23至1300.16 ppm。d)PBS中SeSe纳米胶束的代表性透射电子显微镜(TEM)图像，插图是单个纳米胶束的高强度图像。比例尺：100 nm。e)使用TMA-DPH作为荧光探针检测SeSe纳米胶束的临界胶束浓度（CMC）。对应于交点的横坐标表示lg CMC。f)通过纳米颗粒跟踪分析仪器（NTA）测量的SeSe纳米胶束的尺寸分布。g)SeSe胶束在不同浓度的H 2 O 2反应15分钟后的Rapa释放率，当受到50和100μm的H2O2浓度时，超过98％的R释放。h)SeSe胶束在含有不同浓度H2O2的PBS中的形态和粒径频率的TEM图像。SeSe胶束的大小与H2O2浓度相关并且在100μmH2O2中破裂。

图2、负载SeR纳米胶束(PSeR)的可注射PEGS-PGA水凝胶的制备和表征。a)PEGS-PGA通过羧基调节衰老微环境的示意图。b)PEGS-NH 2的1 H NMR分析。c)均匀分散在PEGS-PGA中的SeSe/FITC胶束的荧光图像。d)可注射PSe水凝胶的照片，该水凝胶具有对复杂轮廓的形状适应性和对骨缺损的粘附力。成型时间小于60秒。e)P和PSe水凝胶在10µm FeSO 4溶液中对Fe 2+的螯合能力。g)P和Pse水凝胶的FT-IR光谱。f)Fe2p3/2和Fe2p1/2峰的XPS谱。h)P和PSe水凝胶对·OH清除的影响。SA与Fe2+和H 2 O 2反应用作对照。i)通过510 nm处的特征吸光度测量羟基自由基的相对残留量。j)Rapa在不同浓度的H2O2下从PSeR水凝胶中的累积释放曲线。

图3、PSeR水凝胶调节衰老BMSCs的细胞内和细胞外ROS水平，并提高衰老BMSCs的体外抗氧化能力。a)微电极监测动物血清氧化还原电位。b)HORAC荧光素探针检测动物血清的抗氧化能力。c)DCFH-DA荧光染色和JC-1荧光染色检测CM诱导的BMSC。比例尺：200µm。d,e)流式细胞术检测BMSCs的DCFH-DA荧光强度。f)使用JC-1试剂通过荧光共聚焦和定量分析检测线粒体膜电位。比例尺：100µm.g,h)Sirt1和Sod2的定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)分析。i,j)经水凝胶处理后BMSC中LC3B蛋白的表达。i,k)水凝胶处理后BMSC中γH2A.X蛋白的表达。

图4、PSeR水凝胶通过体外干预衰老来改善衰老干细胞的功能。a)对水凝胶处理3天的BMSC中的p16和p53进行qRT-PCR分析。b)水凝胶处理3天的BMSC中SASP因子的qRT-PCR分析。c)BMSC的SA-β-gal染色。比例尺：100µm。d,e)BMSCs与水凝胶在成骨基质中共培养14天和21天后的ALP染色和ARS染色。比例尺：100µm。f)第14天的ALP活性量化。g)第21天的ARS活性量化。

图5、PSeR治疗减弱衰老BMSC中年龄相关通路的表达。a)维恩图，显示Y与S以及S处理与S处理的BMSC的DEG。b)热图，代表Y与S处理与S处理的前100个显着基因表达值。c)Y与S显着差异表达基因(DEG)的代表性KEGG通路（p≤0.05，|log倍数变化|≥1）。d)S处理与S处理显着不同的表达基因的代表性KEGG通路（p≤0.05，|log倍数变化|≥1）。e)Y与S以及S处理与S的MSC的GSEA图（|NES|>1，标称p值<0.05，FDR<0.25）。f)示意图总结了S处理与S处理的DEG与G1到S过渡期间细胞周期调节相关的DEG，通过KEGG通路聚类进行分析。


结论与展望


衰老引起的活性氧（ROS）水平失衡是损害老化骨组织再生的主要因素。在这项研究中，研究人员通过组装可注射的聚（γ-谷氨酸）交联氨基功能化聚（癸二酸甘油酯）水凝胶，开发了一种多层次ROS清除系统，该水凝胶含有负载雷帕霉素（PSeR）的聚（二硒化物-碳酸酯）纳米胶束。Unisense微电极系统被用于测量血清的REDOX电位。REDOX电位是衡量氧化还原状态的指标，可以反映血清中氧化剂和还原剂之间的平衡。在老化和退行性疾病的研究中，了解血清的REDOX状态对于评估细胞的抗氧化能力和氧化应激水平是非常重要的。研究结果表明，这种创新系统有效地消除了细胞内ROS的积累，并在整个老化骨修复过程中维持了有利的细胞外氧化环境。此外通过ROS的多层次调控，我们成功地通过靶向细胞周期和DNA复制来干预骨髓间充质干细胞（BMSC）衰老。体内研究进一步证实了PSeR在增强老化骨组织再生方面的功效。这项研究提出了一种通过ROS清除材料的设计来恢复衰老骨骼再生的新策略，并为促进退行性相关疾病治疗的治疗概念提供了宝贵的见解。