研究简介:放疗诱导的前药激活为降低癌症化疗的全身毒性提供了一种理想策略，但可被辐射激活的保护基种类十分有限。针对"放疗激活前药"策略中长期存在的可移除保护基种类少、效率低、化学选择性差这一瓶颈，提出将经典的光诱导电子转移（PET）化学引入放射化学：由于电离辐射在肿瘤内主要裂解水生成羟基自由基、氢自由基和水合电子，而保护基捕获 e⁻ₐq 生成阴离子自由基的过程与 PET 的单电子还原高度相似，作者推测经典 PET 可移除基团 N-烷基-4-吡啶鎓（NAP）同样可被 X 射线活化。研究以 4-吡啶甲基笼锁香豆素为功能报告分子，系统比较了 9 种吡啶甲基、喹啉甲基与吡啶鎓类化合物，发现邻、对位取代活性高于间位，正电荷能显著提升释放效率。本研究表明，发展成熟的光诱导电子转移（PET）化学有望为开发通用型辐射可移除保护基开辟新路径。借助功能性报告分子筛选体系，我们发现 N-烷基-4-吡啶鎓（NAP）可作为一种笼锁基团，能够高效响应辐射并释放客体分子。在竞争实验中，NAP 片段的效率优于迄今已报道的其他辐射可移除保护基。利用这一特性，我们开发了 NAP 衍生的氨基甲酸酯连接子，可在辐射条件下释放荧光分子与毒素，并将其引入抗体偶联药物（ADC）的设计之中。所构建的 ADC 在活细胞及荷瘤小鼠中均展现出良好活性，显示出将该辐射可移除保护基用于开发稳定性更强、疗效更优的新一代 ADC 的巨大潜力。


Unisense 优尼森微电极系统的应用


Unisense 氧微电极在本研究中承担的是放射化学实验中的"条件把关"角色。氧气是与氢自由基的强效清除剂，溶液中残留的溶解氧会直接压制释放效率，因此所有体外辐射实验都必须先把反应体系处理成缺氧状态，以模拟实体瘤的缺氧微环境。作者采用冻融法（freeze–thaw，溶液冷冻后抽真空再解冻）对 1–2 ml 反应液进行脱气，而 Unisense 微电极的作用正是对脱气后溶液中的 O₂ 浓度进行定量测定，确证体系已达到预设的缺氧/除氧水平，从而保证所测得的释放效率确实源于 e⁻ₐq 介导的单电子还原路径，而不是被残余氧气干扰后的假象。unisense微电极也用于界定并核实不同对照组实际的氧浓度环境。Unisense 微电极是本研究中保障"缺氧反应条件可重复、可量化、可核验"的关键质控工具，它为整个辐射还原化学体系的可靠性与剂量—释放线性关系的成立提供了环境参数的实证支撑。


实验结论


受光诱导电子转移（PET）的启发，发展了一种放疗诱导的前药激活策略。竞争实验表明，NAP 片段是迄今最高效的放疗可移除保护基，在生理条件下对水合电子（e⁻ₐq）的反应活性高于既往报道的各类基团。我们设计了一种氨基甲酸酯连接子，能够在辐射条件下高效释放荧光分子与毒素。在活细胞及荷瘤小鼠中开展的实验，有望推动开发稳定性更强、治疗效果更优的新一代抗体偶联药物（ADC）。该策略若与免疫疗法相结合，或将为难以手术切除的肿瘤提供治疗希望，从而满足尚未被满足的临床需求。我们希望这项工作能够弥合光化学与辐射化学之间的鸿沟，为拓展辐射可移除保护基的种类开辟新的可能，并为放疗诱导的可控药物释放策略提供新的思路。

图1、辐射诱导NAP官能团活化以释放功能性分子。a，水的电离辐射产生多种活性粒子，其中·OH和e−aq为主要产物，其电离产额（也称为G值）为280 nM Gy−1。b，先前研究中报道的用于放射治疗诱导前药激活策略的结构，通过·OH、·H或e−aq实现。c，经PET工艺还原的NAP基团释放出功能性分子。d，在本研究中，NAP通过放射治疗产生的e−aq释放出功能性分子。得益于该反应，含氨基（或羧基）的荧光分子或药物可在肿瘤组织中实现时空特异性的激活。MMAE是一种强效抗肿瘤剂，通过阻断微管聚合抑制细胞分裂。

图2、NAP组被识别为一种可被水中电离辐射产生的e⁻·H₂O迅速去除的掩蔽组。a，通过辐射诱导脱保护反应测定的化合物结构。b，化合物1–9（10 μM）在磷酸盐缓冲液（pH 7.4，0.1% DMSO作为共溶剂）中接受60 Gy X射线照射后释放愈创木酚的效率总结。c，化合物7在分别用·OH淬灭剂和e⁻·H₂O淬灭剂处理时，辐射诱导愈创木酚释放的相对效率（n = 3次独立实验，平均值±标准差）。d，辐射诱导释放反应的拟议机制。R′COOH是需要释放的功能性分子，在此以乙酸作为模型分子，其中甲基（CH₃）为特定的R′基团。e，化合物1′–9′的e⁻·H₂O捕获（EC）释放的能量，表明化合物7′–9′的第一步速率常数更高。f，第二步的活化能（Ea），表明化合物7′在辐射诱导释放反应中具有最高的效率。。

图3、NAP组与其他可被辐射解除的保护基之间的释放效率竞争分析。a，示意图表示辐射诱导的NAPC还原过程，可远程释放“封盖”氨基酸分子AMC。b，化合物10在25°C下接受临床相关剂量梯度辐射（0–60 Gy）时的UPLC谱图（10 μM，0.02 M磷酸盐缓冲液，pH 7.4），检测器波长为342 nm。c，AMC的释放量与辐射剂量呈线性关系（0–60 Gy；n = 3次独立实验，平均值±标准差）。d，其他化合物的化学结构已知在辐射诱导还原中具有高效性。e–g，混合物化合物10 + 11（e）、10 + 12（f）、10 + 13（g）（10 μM，0.02 M磷酸盐缓冲液，pH 7.4）在25°C下经或未经60 Gy辐照时的UPLC谱图。h，竞争反应百分比（n = 3次独立实验，平均值±标准差，双尾非配对学生t检验）。

图4、将放射治疗诱导的NAPC系统控制的还原-释放策略应用于ADC。a，NAPC-ADC共轭物的设计。NAPC连接子被还原以释放羧酸酯，该物质发生脱羧反应后重新转化为高度有毒的MMAE。b，通过疏水相互作用高效液相色谱法测定NAPC-ADC共轭物的纯度。c，MALDI-TOF分析表明ADC的药物与抗体比值主要为4。d，不同剂量辐射下药物的释放情况（[NAPC-ADC] = 100 nM，n = 3次独立实验，平均±标准差）。e，在缺氧条件下，使用NAPC-ADC（100 nM）单独或联合X射线（4 Gy）处理4T1-FAP细胞的细胞存活率检测（n = 5孔，平均±标准差，为三次独立实验的代表性数据）。f，利用共聚焦显微镜通过α-微管蛋白免疫检测，评估NAPC-ADC + X射线处理后MMAE的生成，从而导致4T1-FAP细胞细胞骨架中微管蛋白的失稳。比例尺：25 μm。

图5、放射治疗诱导的NAPC-ADC控释可引发小鼠肿瘤消退。a，4T1-FAP肿瘤携带小鼠在静脉注射[89Zr]Zr-NAPC-ADC后不同时间点的动态正电子发射断层扫描-计算机断层扫描图像。SUV为标准化摄取值；t表示肿瘤。共进行了三次独立实验，图中显示代表性结果。b，[89Zr]Zr-NAPC-ADC在血液、肌肉和肿瘤中的靶向摄取（n = 3次独立实验；三只小鼠，平均±标准差）。c，小鼠分别仅注射NAPC-ADC（5 mg kg−1）或同时接受X射线照射（4、8、12和16 Gy）后，检测肿瘤中MMAE的浓度（n = 4个独立生物样本，来自四只小鼠，平均±标准差，双尾非配对学生t检验）。d，4T1-FAP肿瘤携带小鼠的治疗方案：二十只BABL/c小鼠皮下植入4T1-FAP细胞，随机分为四组（n = 5个独立生物样本；五只小鼠），分别接受PBS处理、NAPC-ADC（5 mg kg−1，静脉注射）、放射治疗（按指定剂量）；或NAPC-ADC（5 mg kg−1）联合放射治疗（每次4 Gy，每两天一次）。e，各治疗方案后肿瘤携带小鼠的肿瘤生长曲线(n = 5个独立生物样本；五只小鼠，均值±标准差，采用Bonferroni多重比较t检验的双因素方差分析)。f，第21天肿瘤平均重量（n = 5个独立生物样本；五只小鼠，均值±标准差）。g，小鼠体重变化曲线。


结论与展望


放疗诱导的前药激活为降低癌症化疗的全身毒性提供了一种理想策略，但可被辐射激活的保护基种类十分有限。本研究表明发展成熟的光诱导电子转移（PET）化学有望为开发通用型辐射可移除保护基开辟新路径。借助功能性报告分子筛选体系，本研究发现 N-烷基-4-吡啶鎓（NAP）可作为一种笼锁基团，能够高效响应辐射并释放客体分子。在竞争实验中，NAP 片段的效率优于迄今已报道的其他辐射可移除保护基。利用这一特性，我们开发了 NAP 衍生的氨基甲酸酯连接子，可在辐射条件下释放荧光分子与毒素，并将其引入抗体偶联药物（ADC）的设计之中。所构建的 ADC 在活细胞及荷瘤小鼠中均展现出良好活性，显示出将该辐射可移除保护基用于开发稳定性更强、疗效更优的新一代 ADC 的巨大潜力。Unisense 微电极是本研究中保障"缺氧反应条件可重复、可量化、可核验"的关键质控工具，它为整个辐射还原化学体系的可靠性与剂量—释放线性关系的成立提供了环境参数的实证支撑，