结果


人PTC的氧消耗


分离的人PTC不受L-NAME单独影响，而碘普罗胺和碘克沙醇均显著降低QO₂（图1）。在L-NAME存在下，碘普罗胺和碘克沙醇对氧消耗的影响均被阻断。

图1. 新鲜分离的人近端肾小管细胞与一氧化氮合酶非特异性抑制剂L-NAME（10 μg/mL）、造影剂碘普罗胺（10 mg I/mL）或碘克沙醇（10 mg I/mL）或其组合孵育前后的氧消耗（每组n=7）。P<0.05 vs 基线。所有数值均为均值±SEM。

大鼠PTC的氧消耗

图2. 从对照（A）或糖尿病大鼠（B）新鲜分离的大鼠近端肾小管细胞的氧消耗。细胞与一氧化氮合酶非特异性抑制剂L-NAME（10 μg/mL）、造影剂碘普罗胺（10 mg I/mL）或碘克沙醇（10 mg I/mL）或其组合孵育（每组n=8）。P<0.05 vs 同组基线。所有数值均为均值±SEM。

与相应对照相比，从糖尿病大鼠分离的PTC基线QO₂升高（图2）。从正常血糖对照大鼠制备的PTC不受L-NAME、碘普罗胺或两者组合的影响（图2A）。然而，碘克沙醇降低了它们的QO₂，且L-NAME不能阻断此降低。当检查从糖尿病大鼠制备的PTC时，L-NAME单独无影响，而碘普罗胺和碘克沙醇均降低其QO₂（图2B）。L-NAME完全阻断碘普罗胺的影响，但不能阻断碘克沙醇的影响。


蛋白鉴定


针对nNOS和eNOS的Western blot显示，人和大鼠PTC中均存在nNOS（图3），后者无论细胞来自糖尿病还是非糖尿病动物。然而，未能检测到eNOS的存在。

图3. 针对神经元型（n）和内皮型（e）一氧化氮合酶的Western blot，证实分离的人和大鼠近端肾小管细胞中存在NO生成酶。


讨论


我们的研究表明，当新鲜分离的人PTC暴露于造影剂时，QO₂降低。用L-NAME抑制NO合酶产生的NO可完全阻断此效应，表明造影剂诱导NO释放，进而抑制QO₂。在暴露于碘普罗胺的糖尿病大鼠PTC中观察到类似反应。然而，从对照大鼠分离的PTC不受碘普罗胺影响。


尽管碘克沙醇降低从对照或糖尿病大鼠分离的PTC的QO₂，此效应不依赖于NO合酶来源的NO，因为L-NAME不能阻断此效应。这些新发现展示了一条新途径，即造影剂可通过诱导NOS释放NO直接影响肾上皮细胞，这可能影响细胞ATP生成，进而影响细胞能量代谢和功能。结合既往显示氧输送亦受损的研究，这些结果为CIN的发生提供了一种新机制。


已明确NO在线粒体水平抑制QO₂。造影剂诱导细胞内NOS释放NO将降低线粒体QO₂，进而可能减少ATP生成。如果这在体内也发生，则可能构成一个严重问题，并叠加于其他功能问题之上，如肾血流和GFR降低。然而，既往一项研究中，糖尿病大鼠在碘普罗胺给药后未显示皮质血流减少，反而略有增加。这提示给予糖尿病大鼠碘普罗胺可诱导血管舒张，与我们的研究发现一致，即碘普罗胺诱导人和糖尿病大鼠肾脏分离的PTC显著释放NO。


既往已报道糖尿病大鼠肾脏中NO减少，这增加QO₂，导致肾脏氧可用性降低。组织缺氧确实已被认为是慢性肾脏病的统一通路。因此，造影剂诱导NO释放继而降低QO₂可能具有损伤作用，这似乎矛盾。然而，肾脏能量需求的绝大部分（约80%）用于滤过电解质的主动重吸收。血管舒张伴随ATP生成减少，将给本已脆弱的器官带来额外负担。


为什么正常人肾细胞对碘普罗胺显示QO₂降低，而相应的大鼠细胞却无此反应？一个合理的解释是，我们从老年受试者分离的PTC不能被视为与对照大鼠细胞制备物相对应的真正的"对照"细胞。我们不想夸大患者材料中的风险因素，但它们很可能对结果有贡献。肾切除患者的平均年龄为61岁，已明确肾功能随年龄下降且是CIN的独立风险因素。此外，患者有高血压和计算GFR降低，这些也构成CIN的风险因素。持续性糖尿病合并既有肾功能损害也是CIN发生的强独立风险因素，这可能是我们的人PTC与糖尿病大鼠PTC结果相似的原因。


我们证实nNOS是PTC中表达的主要同工型。这与Deng等人的既往报告一致。他们显示，分离的大鼠PTC的QO₂被NO抑制，且高选择性nNOS抑制剂S-甲基-L-硫代瓜氨酸可阻断NO的抑制作用。我们的研究结果显示，在从老年人分离的PTC中，碘普罗胺和碘克沙醇均可诱导nNOS释放NO，进而抑制QO₂。碘普罗胺在糖尿病PTC中诱导类似的NO依赖性QO₂抑制。然而，碘克沙醇抑制从糖尿病和对照大鼠制备的PTC的QO₂，此效应不能被NOS抑制阻断。造影剂是否也能诱导其他NOS同工型释放NO尚待研究。本研究中两种不同造影剂降低QO₂所涉及机制的差异尚不清楚，也未进一步研究。然而，已知造影剂性质的差异对肾功能有不同影响。


我们的研究表明，碘化造影剂抑制从老年人和大鼠分离的PTC的细胞QO₂，这可能是由于造影剂诱导的NO释放。然而，NO释放的诱导及其对细胞氧代谢的后续影响取决于多种因素，包括造影剂类型以及PTC是否来源于具有已知CIN发生既有风险因素的患者。


利益冲突声明


P. Liss此前曾获得拜耳公司（Bayer AG）的资助。其余作者声明无利益冲突。


资助信息


本项目获得瑞典研究理事会医学与健康、瑞典糖尿病基金会和瑞典医学研究委员会的资助。