摘要


目的：造影剂（CM）诱导的肾病（CIN）的潜在机制仍不明确，但近期研究已将注意力转向氧的可用性。本研究的目的是评估低渗造影剂碘普罗胺（iopromide）和等渗造影剂碘克沙醇（iodixanol）对氧消耗（QO₂）的影响，实验材料为从接受肾癌肾切除术的老年患者肾脏以及正常血糖或链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾脏中新鲜分离的近端肾小管细胞（PTC）。


材料与方法：从人肾脏或正常血糖/链脲佐菌素糖尿病大鼠肾脏中分离PTC。在气密 chamber 中使用Clark型微电极测量QO₂，测量条件为有无造影剂（10 mg I/mL培养基）。使用L-NAME抑制一氧化氮合酶产生的一氧化氮（NO）。


结果：两种造影剂均降低人PTC的QO₂（约–35%），此效应可被L-NAME阻断。正常血糖大鼠的PTC不受碘普罗胺影响，而碘克沙醇降低QO₂（–34%）。两种造影剂均降低糖尿病大鼠PTC的QO₂（分别为–38%和–36%）。L-NAME仅能阻断碘普罗胺对糖尿病大鼠PTC的影响。


结论：这些观察结果表明，造影剂可在体外诱导分离的PTC释放NO，从而影响QO₂。我们的结果提示，NO释放的诱导及其对细胞氧代谢的后续影响取决于多种因素，包括造影剂类型和既有的CIN发生风险因素。


引言


造影剂诱导的肾病（CIN）是住院患者急性肾功能衰竭的第三大病因，占所有病例的10%。CIN的潜在病因尚待阐明，但已提出多种机制，其中以肾髓质缺氧性损伤为主导。由于肾髓质的血管结构具有逆流交换血管（直小血管），在正常生理条件下氧可用性已较低。此外，与肾损伤发生密切相关的疾病状态（高血压和糖尿病）会进一步降低肾组织中的氧可用性。既有的肾功能损害是CIN发生的公认风险因素。因此有学者提出，造影剂可能引起髓质缺氧，从而导致CIN的发生。最可能的情况是多种机制共同作用导致CIN，但造影剂对肾小管细胞的直接作用的病理生理相关性仍存在争议，其他已提出的病因学机制亦然。


值得注意的是，只要能量需求保持在较低水平（例如因冷却而降低代谢），大多数细胞对缺氧本身具有相当好的耐受性。然而，无论是线粒体氧利用减少还是线粒体电子传递链（进而ATP生成）受抑制所导致的腺苷三磷酸（ATP）匮乏，都是一种更为严重的状态，会激活多种通路以对抗ATP供应的减少。已证实一氧化氮（NO）是肾血流（即氧输送）的重要调节因子，但也直接影响氧可用性以调节线粒体的氧利用。众所周知，髓质是造影剂诱导损伤的主要部位，但我们在本研究中使用近端肾小管细胞（PTC）来研究不同造影剂的影响。选择此方法有两个主要原因：PTC可从人肾脏中以测量氧消耗（QO₂）所需的相对较大量分离获得；它们代表一种高代谢活性的细胞类型，因其具有与髓袢升支粗段细胞相似的高电解质转运特性，而后者被认为是造影剂诱导损伤的部位。


本研究的目的是评估低渗造影剂碘普罗胺和等渗造影剂碘克沙醇对QO₂的影响，实验材料为来自肾切除术老年人肾脏以及正常血糖或链脲佐菌素糖尿病大鼠肾脏的新鲜分离PTC。


材料与方法


乌普萨拉大学机构审查委员会批准了所有涉及患者的方案，所有患者在入组前均签署了知情同意书。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）实验动物使用与护理指南进行，并获得当地动物护理与使用委员会批准。除另有说明外，所有化学品均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯），为最高可用等级。


患者资料


记录体重、身高和血压。于手术前一天采集静脉血样本：含凝胶/肝素锂的真空采血管（Kronans Droghandel，瑞典斯德哥尔摩）用于血浆肌酐分析，含凝胶的采血管用于血清C肽分析，含EDTA的采血管用于HbA1c分析。患者因肾癌入院接受单侧肾切除术。


表1. 患者特征（n=7）
年龄（岁） 63.7 ± 4.3
血浆肌酐（mmol/L） 85 ± 7
计算GFR（mL/min） 82 ± 10
血清C肽（nmol/L） 2.64 ± 0.45
糖化血红蛋白（%） 5.20 ± 0.13
收缩压（mmHg） 147 ± 6
舒张压（mmHg） 86 ± 3
身体质量指数（kg/m²） 27.6 ± 1.0

分配至本研究的肾脏供者（n=7）显示出CIN发生风险增加患者的典型特征，包括肾小球滤过率（GFR）降低、血压升高和体重指数增加（表1）。每位供者均单独研究和分析。


人近端肾小管细胞的分离


人PTC按照Hawksworth最初描述的方法的改良方案分离，获得的细胞悬液含PTC超过95%。简言之，将肾切除肾脏中经外科医生确定肉眼健康的切除部分（1–8 g组织）置于冰冷平衡盐溶液（BBS）中（mmol/L：5.37 KCl，0.44 KH₂PO₄，137 NaCl，0.34 Na₂HPO₄，1.35 NaHCO₃，5.56 D-葡萄糖，25 HEPES，0.5 EGTA，0.5% BSA，50 mg/L链霉素；pH 7.2）。在显微镜下（10倍放大）解剖肾皮质，用手术刀粗略切碎，转移至新的冰冷BBS中，100 g离心2分钟。沉淀重悬于DMEM/Ham's F12营养混合物（1:1，含15 mmol/L HEPES，14.28 mmol/L NaHCO₃，50 mg/L链霉素），重复离心三次。最终沉淀重悬于37°C的DMEM/Ham's F12中，含0.4%（w/v）胶原酶A（溶组织梭菌，0.5 U/mg），37°C孵育70分钟。然后将细胞悬液置于冰上冷却，过滤（孔径180、75、53和38 μm），离心沉淀（400 g，4分钟），最后重悬于无胶原酶的DMEM/Ham's F12。在QO₂分析前，此程序重复三次。每位患者的PTC在后续氧消耗计算中均按n=1处理。


大鼠糖尿病的诱导


成年雄性Sprague-Dawley大鼠（Scanbur，瑞典索伦蒂纳）自由饮用自来水和标准大鼠饲料（R3，Ewos，瑞典瑟德泰尔耶）。通过尾静脉单次注射链脲佐菌素（55 mg/kg）诱导糖尿病。若血糖浓度在24小时内升高至≥15 mmol/L并保持升高，则认为动物成模。血糖浓度用试纸法（MediSense，美国马萨诸塞州贝德福德）测定，血样取自尾尖切口。


年龄匹配对照组（n=8）的体重为493±68 g，糖尿病组（n=8）为313±13 g；血糖浓度分别为7.3±0.1和29.7±0.7 mmol/L。每只大鼠均单独研究和分析。


大鼠近端肾小管细胞的分离


缓冲液成分（除另有说明外，mmol/L）：113.0 NaCl，4.0 KCl，27.2 NaHCO₃，1.0 KH₂PO₄，1.2 MgCl₂，1.0 CaCl₂，10.0 HEPES，0.5 Ca²⁺-乳酸，2.0谷氨酰胺，渗透压调至300±2 mOsm/kg H₂O，pH调至7.40。加入链霉素（VWR International，瑞典斯德哥尔摩），终浓度50 U/mL。非糖尿病大鼠缓冲液含5.8 mmol/L葡萄糖，糖尿病动物缓冲液含23.2 mmol/L葡萄糖（与后者血糖浓度相似）。糖尿病诱导两周后，按先前描述的方法分离PTC。简言之，用硫代丁巴比妥麻醉大鼠，取出肾脏置于冰上，解剖皮质。皮质组织通过金属网筛切碎，立即置于含0.05%（w/v）胶原酶的冰冷缓冲液中。切碎的组织于37°C孵育，缓冲液以95% O₂/5% CO₂平衡，每5分钟手动搅拌一次。细胞悬液置于冰上冷却，经分级滤器过滤（孔径180、75、53和38 μm），随后处理与人PTC类似。


体外氧消耗测量


QO₂按先前描述的方法测量。使用定制的恒温控制（37°C）气密有机玻璃chamber，总体积1.10 mL。改良的Unisense 500 O₂传感电极（Unisense，丹麦奥胡斯），用空气平衡缓冲液（设定为228 μmol/L O₂）和Na₂S₂O₅饱和缓冲液（设定为零）校准，测量O₂消耗。校准后，将100 μL细胞悬液注入chamber，记录O₂消失速率并按蛋白浓度校正（DC蛋白测定；Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）。除基线QO₂测量外，细胞还预孵育30分钟，孵育条件为：NO合酶抑制剂Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME；10 μg/mL）、碘普罗胺（10 mg I/mL；590 mOsm/kg H₂O；Schering AG，德国柏林）、碘克沙醇（10 mg I/mL；290 mOsm/kg H₂O；GE Healthcare，瑞典斯德哥尔摩），或L-NAME与碘普罗胺或碘克沙醇的组合。QO₂测量期间的造影剂浓度计算为等于临床检查中PTC在体内暴露的最高浓度。L-NAME是最常用的三种NO合酶同工酶抑制剂。每次QO₂测量均重复进行，平均值记为n=1。


Western blot分析


分离的PTC与裂解缓冲液（1.0% NP40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS，10 mM NaF，80 mM Tris；pH 7.5）按1:1混合，裂解缓冲液含酶抑制剂（Complete Mini；1片/3 mL；Roche Diagnostics，德国曼海姆）。大鼠脑组织总匀浆用作阳性对照。样品在7.5% Tris-HCl凝胶上用Tris/甘氨酸/SDS缓冲液电泳。蛋白转移至硝酸纤维素膜后，用兔抗nNOS（2 μg/mL；Zymed Laboratories，Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）、兔抗eNOS（1:2000；Sigma-Aldrich）和HRP标记的羊抗兔二抗（1:5000；Sigma-Aldrich）检测，通过ECL相机（Kodak图像工作站2000；美国康涅狄格州纽黑文）显影。


统计学


所有数值均为均值±标准误（SEM）。同一组内的多重比较采用重复测量方差分析（ANOVA），随后用Dunnett检验进行配对比较（Statview，Abacus Concepts，美国加利福尼亚州伯克利）。两组数据比较采用非配对Student's t检验。P<0.05认为有统计学意义。