3.3 生物膜的表观与微观形貌


砂浆载体表面在不同阶段形成的生物膜的表观形貌如图8所示。可见，最初几天砂浆表面形成了少量菌落，随着时间推移，这些菌落逐渐聚集，生物膜量开始增加，最终形成完整成熟的生物膜。此外，附着于砂浆表面的生物膜颜色由泥灰色变为黄色，最终变为黑色。生物膜变黄可能是由于硫的存在，表明同时发生了H₂S的产生与氧化（图8b）；而黑色生物膜可能是由于污水中拟杆菌门微生物代谢产生的黑色素所致（图8c）。这些结果表明生物膜内发生了一系列生化反应。

图8 砂浆载体上生物膜的表观形貌：(a) 5 d，(b) 15 d，(c) 30 d


通过连续拍摄不同深度处生物膜的共聚焦图像，将生物膜进行三维重建，如图9所示。可见，生物膜的三维结构呈平板状，厚度较为均匀，但其内部结构更为复杂，由多种细菌与菌落交织而成，存在许多间隙和孔隙。

图9 生物膜的三维结构：(a) 正视图，(b) 侧视图


图10显示了生物膜BS3从顶部（靠近污水）到底部（靠近砂浆）不同深度处的CLSM图像。可以发现，当生物膜层主要位于靠近砂浆表面时，微生物数量较少。这可以从以下两方面解释：一方面，随着微生物在砂浆表面的附着与生长，逐渐增厚的生物膜可能抑制了营养物质向生物膜深层的传输，从而影响微生物的生长繁殖，因此靠近污水的生物膜表层微生物数量明显多于生物膜底层；另一方面，砂浆表面的碱性环境不利于微生物生长。大多数细菌的最适pH值为6.5–7.5，一旦超出该最适pH范围，酶活性和细胞膜稳定性将受到影响，进而影响微生物对营养物质的吸收。

图10 生物膜从顶部（左上角）到底部（右下角）不同深度处的CLSM图像


3.4 生物膜的孔隙率分析


对在不同浓度污水中砂浆表面形成的生物膜，沿深度方向每20 μm逐层扫描，对获得的CLSM图像用图像分析软件进行分析，计算孔隙面积与总面积之比。例如，生长30天的生物膜在不同深度处的面积孔隙率结果见表2。可见，面积孔隙率随生物膜深度增加而增大，二者呈线性关系，这与已有报道一致。


表2 不同浓度污水中生物膜的面积孔隙率（%）
生物膜深度 (μm) BS1 BS2 BS3 BS4
0 61.57 28.49 15.52 11.13
20 63.16 30.13 17.55 13.13
40 66.21 33.73 20.14 16.83
60 69.35 36.10 23.58 19.01
80 71.47 38.47 25.97 22.63
100 74.50 42.18 28.39 24.83
120 77.13 45.11 30.59 27.11
140 80.18 47.93 33.34 30.18
160 83.13 50.03 36.12 33.34
180 86.62 53.47 39.11 36.15
200 88.61 56.39 41.46 31.92
220 91.38 59.23 44.07 34.14
240 94.14 62.07 46.69 36.37
260 96.90 64.91 49.31 38.59
280 99.66 67.75 51.93 40.81
300 100 70.59 54.55 43.03
320 — 73.43 57.17 45.25
340 — 76.27 59.79 47.48
360 — 79.11 62.40 49.70
380 — 81.95 65.02 51.92
400 — 84.79 67.64 54.14
420 — 87.63 70.26 56.36
440 — 90.48 72.88 58.59
460 — 93.32 75.50 60.81
480 — 96.16 78.11 63.03
500 — 98.99 80.73 65.25
520 — 100 83.35 67.47
540 — — 85.97 69.70
560 — — 88.59 71.91
580 — — 91.21 74.14
600 — — 93.82 76.36
620 — — 96.44 78.58
640 — — 99.06 80.81
660 — — 100 83.03
680 — — — 85.25
700 — — — 87.47
720 — — — 89.70
740 — — — 91.92
760 — — — 94.14
780 — — — 96.36
800 — — — 98.58
820 — — — 100


注：500 μm以内生物膜的面积孔隙率为实测值，500 μm以外为根据回归方程计算值。


基于300 μm深度内生物膜的面积孔隙率数据，采用线性回归分析确定面积孔隙率与生物膜深度之间的相关性，结果如图11所示。可见，不同浓度污水中生物膜的相关系数R²均大于0.99，表明面积孔隙率与生物膜深度之间存在很强的线性关系。此外，不同污水环境下拟合直线的斜率几乎相同，介于0.11–0.14之间，说明生物膜沿深度方向分布均匀；而拟合直线的截距，即生物膜表层的面积孔隙率，与污水环境密切相关：污水浓度越高，拟合直线的截距或面积孔隙率越小，换言之，生物膜结构越致密。

图11 人工污水中生物膜面积孔隙率与深度的关系：(a) BS1，(b) BS2，(c) BS3，(d) BS4


受CLSM测量范围限制，仅测量了500 μm以内生物膜的面积孔隙率。然而，可根据线性回归方程计算人工强化污水中深度超过500 μm处生物膜的面积孔隙率，结果列于表2。由此可推断，生物膜BS2、BS3、BS4的厚度分别约为520、660、820 μm。此外，生物膜的孔隙率应表征三维空间，而面积孔隙率是根据二维图像计算得到的。已有研究提出了建立面积孔隙率与生物膜真实三维孔隙率之间关系的公式：


BP = ∫₀^(Lb) (AP)x dx / Lb  （3）


式中：BP为生物膜三维孔隙率，%；(AP)x为距生物膜顶部x处的面积孔隙率，%；Lb为生物膜厚度，μm。


本研究还发现，生物膜孔隙率等于沿生物膜深度剖面测得的面积孔隙率的平均值。由此可推算生物膜的孔隙率。同理，可测定并计算生长15、45、90天生物膜的孔隙率，结果见表3。可见，随生长时间延长，生物膜孔隙率总体呈逐渐下降趋势，但强化污水中生物膜的孔隙率在45天后变化不大。生物膜孔隙率还随污水浓度升高而降低，这与已有报道中"随基质负荷降低、生物膜平均密度增大"的结论相反。其主要原因可能是本研究中污水流速较高，强烈的生物膜脱落导致生物膜因表面持续更新而压实。因此，污水浓度与水力条件均影响生物膜的生长与形成。


表3 不同浓度污水中生物膜的孔隙率
生物膜试样 15 d 30 d 45 d 90 d
BS1 93.2 81.7 73.7 65.3
BS2 82.4 64.9 56.4 53.8
BS3 70.5 58.5 51.2 52.4
BS4 66.3 55.3 48.8 50.6


3.5 生物膜的微电极测试


砂浆表面不同阶段形成的生物膜中O₂、PH微电极测试结果如图12–15所示。可见，随污水浓度升高，生物膜生长得更厚。砂浆在污水中浸泡30天后，生物膜BS4的厚度可达800 μm，约为生物膜BS1厚度（300 μm）的2.67倍，这与根据表2中生物膜面积孔隙率推断的生物膜深度结果相近。生长90天时，COD为6000 mg/L和9000 mg/L强化污水中的生物膜（BS3和BS4）厚度明显减小，表明生物膜已开始脱落；而普通污水中的生物膜（BS1）仍在缓慢生长。这一结果表明，人工强化污水中较厚的生物膜更易脱落，其原因可能是硫酸盐和有机化合物向生物膜深层传输受限，导致微生物数量及生物膜黏附力下降。

图12 15天时生物膜的微电极测试结果：(a) BS1，(b) BS2，(c) BS3，(d) BS4

图13 30天时生物膜的微电极测试结果：(a) BS1，(b) BS2，(c) BS3，(d) BS4

图14 45天时生物膜的微电极测试结果：(a) BS1，(b) BS2，(c) BS3，(d) BS4


此外，随污水浓度升高和生长时间延长，生物膜内的pH值均呈下降趋势。普通污水中生物膜BS1的pH值在6–7之间，整个生长期内变化不大。然而，人工强化污水中生物膜的pH变化明显，90天时pH已降至2左右（图15d），呈现强酸环境。而且污水浓度越高，生物膜的pH值越低。这可解释如下：随污水浓度升高，大量的有机化合物和微生物促进了生物膜内硫酸盐还原与硫氧化活性，从而产生更多酸性化合物，导致生物膜内pH值下降。

图15 90天时生物膜的微电极测试结果：(a) BS1，(b) BS2，(c) BS3，(d) BS4


此外，生物膜中的氧分布可反映异养菌与自养硝化菌等争夺氧摄取的微生物分布。由图12可见，生长15天后，形成了200–400 μm厚的生物膜，氧气可完全扩散至生物膜底部，这是由于其结构薄而疏松。然而，随生长时间延长，氧气逐渐被生物膜中的细菌消耗，30天时强化污水中生长的生物膜（BS2、BS3、BS4）内已出现厌氧区（图13b–d），且由于可生物降解基质含量高，生物膜生长速率较快。生长45天后，生物膜厚度达1000 μm，厌氧区进一步扩大（图14c和d），硫酸盐还原菌（SRB）开始大量繁殖。生长90天时，强化污水中生长的生物膜因剥落导致厌氧区消失，而普通污水中生物膜底部检测到厌氧区（图15a）。因此，生物膜的内部特征随龄期、厚度和孔隙率的不同而差异很大。此外，生物膜内氧气变化速率可由式（4）计算。由表4可见，生物膜内氧气变化速率随生长时间延长而逐渐降低。


KDO = (C₀ − C₁) / TB × 100%  （4）


式中：KDO为溶解氧变化速率，mg/L·μm；C₀为生物膜表面氧浓度，mg/L；C₁为生物膜底部氧浓度；TB为生物膜厚度，μm。


表4 生物膜内氧气变化速率（mg/L·μm）
生物膜试样 15 d 30 d 45 d 90 d
BS1 0.0046 0.0045 0.0015 0.0011
BS2 0.0066 0.0034 0.0019 0.0007
BS3 0.0056 0.0048 0.0032 0.0014
BS4 0.0055 0.0042 0.0028 0.0013