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结果

耻垢分枝杆菌 mc²155 组成型氧化对流层H₂

在密封血清瓶中，测量了指数生长期和碳限制培养的 耻垢分枝杆菌 mc²155 的H₂氧化情况。在两种条件下，野生型菌株都氧化了顶空中大部分的H₂。只有当培养物通气并搅动时才发生活性，表明O₂作为末端电子受体。与此活性由[NiFe]氢化酶负责一致，当在培养基中添加外源NiSO₄时，氧化速度提高了四倍。当可获得亚对流层浓度的H₂时，氧化仍在继续。在环境空气顶空的指数生长过程中，野生型菌株消耗了大部分可用的H₂（初始混合比约0.60 ppmv；最终混合比约0.14 ppmv）。此活性依赖于Hyd1，并且在携带该酶无标记敲除的菌株中没有发生。

图1. 耻垢分枝杆菌 mc²155 野生型及其氢化酶敲除突变体在指数生长期（A）和碳限制期（B）的H₂氧化情况。数据点为三次独立实验的平均值，误差线表示标准差。

Hyd1与Hyd2以动力学上不同的活性氧化对流层中的H₂

随后，在延长的时间过程中，测量了处于非复制碳限制状态的 耻垢分枝杆菌 菌株的氢化酶活性。与碳限制期间Hyd1和Hyd2表达增加一致，Hyd1在此条件下更活跃，并且可以分辨出Hyd2的活性。野生型菌株mc²155以一级动力学过程氧化了顶空中可用的H₂（初始混合比约6.3 ppmv）。此活性主要归因于第2a组[NiFe]氢化酶Hyd1；Δhyd23（仅含Hyd1）菌株迅速将H₂氧化至亚对流层浓度（最终混合比约0.21 ppmv）。然而，也观察到了对应于第5组[NiFe]氢化酶Hyd2的高亲和力活性；Δhyd13（仅含Hyd2）菌株缓慢氧化顶空H₂，并在比Δhyd23菌株更低的浓度下发挥作用（最终混合比约0.07 ppmv）。缺乏Hyd3的菌株（Δhyd3）表现与野生型相似，这强化了该酶不在好氧培养物中表达的结论。在缺乏任何氢化酶的菌株（Δhyd123）中，未观察到顶空H₂浓度的显著变化。

图2. 碳限制的 耻垢分枝杆菌 mc²155 野生型及其氢化酶敲除突变体的H₂消耗动力学。数据点为三次独立实验的平均值，误差线表示标准差。插图显示了初始阶段的放大视图。

为进一步分析这些氢化酶，我们在低（6.3 ppmv）和高（500、1000和2000 ppmv）初始H₂混合比下孵育的碳限制培养物中，测定了野生型、Δhyd23（仅含Hyd1）和Δhyd13（仅含Hyd2）菌株的H₂氧化动力学参数。在两种情况下，Hyd1消耗了大部分存在的H₂，而Hyd2的活性低五倍。Hyd1能很好地适应在广泛的H₂浓度范围内发挥作用[Km(app)= 184±40 nM；阈值=133±7 pM]，而Hyd2总体上能氧化更低浓度的H₂[Km(app)=51±16 nM；阈值=54±3 pM]。尽管很明显Hyd1是 耻垢分枝杆菌 中主要的摄取氢化酶，但该酶本质上是比Hyd2更快，还是在细胞中更丰富，仍有待完全确定。

表1. 全细胞中氢化酶活性的动力学参数

氢氧化与膜相关

通过使用细胞组分的酶谱分析和安培检测法确定了摄取氢化酶的定位。Hyd2有效地将H₂的氧化与人工电子受体/氧化还原染料硝基蓝四唑氯化物的还原偶联起来。此活性在膜组分中富集。尝试使用电负性更强的受体，如苄基紫精，未能成功。虽然无法通过酶谱分析法可视化Hyd1的活性，但这种高活性的酶可以使用H₂微传感器检测到。正如之前在蓝细菌第2a组[NiFe]氢化酶中观察到的那样，其活性集中在野生型和Δhyd23菌株的膜组分中。Hyd1和Hyd2缺乏预测的跨膜螺旋和信号肽，并且不与编码可能的膜蛋白的基因共同转录。因此，它们不太可能是经典的膜结合蛋白，而是可能通过两亲性螺旋或蛋白质-蛋白质相互作用与膜的胞质侧结合。

图3. 耻垢分枝杆菌 mc²155 氢化酶的细胞定位。（A）考马斯亮蓝染色的天然凝胶，显示总蛋白。（B）硝基蓝四唑活性染色，显示Hyd2活性。（C）使用H₂微传感器的电流分析法测量，显示Hyd1活性。数据来自代表性的实验。CFE，无细胞提取物；Cyt，胞质溶胶；Mem，膜。

讨论

总之，这项工作证明了 耻垢分枝杆菌 mc²155 通过使用两种膜相关的、依赖氧的[NiFe]氢化酶来氧化对流层H₂。我们最终确认第5组[NiFe]氢化酶可以介导高亲和力H₂氧化，并为这些酶是大气H₂的主要汇的假说提供了强有力的支持。在Δhyd13菌株中单独观察到的以及在Δhyd2菌株中缺失的Hyd2的全细胞H₂氧化动力学参数，与在完整土壤样品和培养的链霉菌中观察到的高亲和力过程非常相似。编码第5组[NiFe]氢化酶的基因在土壤放线菌目成员中广泛存在，也分布于未充分培养的土壤门类中，如酸杆菌门。本研究还清楚地表明，一些第2a组[NiFe]氢化酶有能力氧化低浓度的H₂；然而，鉴于这些酶在已测序的放线菌中发现较少，并且主要在其它生物体中用于回收固氮酶产生的H₂，它们对全球氢预算的贡献可能较小。

图4. 来自不同微生物的摄取氢化酶的H₂氧化动力学比较。显示了表观Km值和Vmax值。数据点代表文献中报道的值。耻垢分枝杆菌 的Hyd1（仅含Hyd1菌株）和Hyd2（仅含Hyd2菌株）的数据来自本研究。其他数据点包括：土壤样品、链霉菌属物种PCB7、富养罗尔斯通氏菌、鱼腥藻属 PCC 7120（吸氢酶和可逆氢化酶）、脱氮副球菌、沼泽红假单胞菌、荚膜红细菌、大豆慢生根瘤菌、腐败希瓦氏菌 和 亨盖特甲烷螺菌。许多携带第5组[NiFe]氢化酶和第2a组[NiFe]氢化酶的生物仍然具有低亲和力。

氧化对流层H₂的能力可能构成土壤生态系统中的一个主要选择压力。这些环境的特点是显著的种间竞争、快速的营养周转以及总体上的能量限制。现在很清楚的是，耻垢分枝杆菌 在纯培养的指数生长期内，会利用H₂和有机碳源进行混合营养生长，这与我们之前的表达和表型研究一致。然而，Hyd1和Hyd2的表达和活性在碳限制期间显著更高。第5组[NiFe]氢化酶在其他放线菌和链霉菌孢子形成期间的能源限制条件下也更活跃。在这样的条件下，H₂可能替代成为主要的电子供体，并用于维持氧化还原平衡和膜电位。第5组[NiFe]氢化酶能在广泛的pH值、温度和O₂浓度下维持催化活性的发现进一步表明，这些酶赋予了应对环境变化的稳健性和灵活性。

Hyd1和Hyd2共享许多特征，包括相似的表达谱、高亲和力氧化活性和膜结合。然而，它们在细胞中的生理作用显然并非冗余。尽管Hyd1持续活跃，但在连续培养中，Δhyd2菌株的生长产量比野生型低40%。因此，Hyd2必须将对流层H₂用于细胞内一个重要且独特的目的，例如维持醌池或细胞内辅因子的还原状态。相比之下，Hyd1很可能是一种呼吸酶，通过将H₂氧化与O₂还原偶联（通过与电子传递链的物理关联）来维持膜电位。这种酶具有高的Vmax(app)，并且在各种H₂浓度下都很高效。它可以代谢在某些微环境中（例如在涝渍或根际土壤中）或由于氧限制期间Hyd3活性而产生的高浓度H₂。该酶还使 耻垢分枝杆菌 能够以比仅携带第5组[NiFe]氢化酶的培养链霉菌显著更快的速率氧化对流层H₂。

Hyd1和Hyd2是首批被明确证明介导高亲和力H₂氧化的氢化酶。它们的表观Km比大多数纯化的摄取氢化酶低10倍以上。然而，造成这种适应的特征仍有待确定；目前仍不清楚这些氢化酶本身是否是内在的高亲和力酶，还是它们的亲和力受到其细胞环境（例如通过它们的氧化还原伴侣以及与呼吸链的相互作用）的调节。奇怪的是，在其他生物体的第5组[NiFe]氢化酶中观察到了多种多样的表观Km值。考虑到这些酶由相对保守的操纵子编码，并且共享非常高的氨基酸序列同一性（>70%），这令人惊讶。我们的多序列比对显示，在表观高亲和力和低亲和力成员之间没有一致的氨基酸替换。Hyd1也是首个被证明能氧化对流层H₂的第2a组[NiFe]氢化酶。值得注意的是，该酶与一个推定的[2Fe-2S]蛋白共同转录，该蛋白很可能作为其生理电子受体。编码同源蛋白的基因与其他第5组[NiFe]氢化酶一起转录，包括Hyd2，但在大多数蓝细菌基因组中不存在。我们提出，这类蛋白可能具有相对较高的氧化还原电位（>-200 mV），从而确保痕量浓度H₂的氧化在热力学上是有利的。同样可以想象的是，耻垢分枝杆菌 的氧化还原代谢或呼吸链的非典型特征可能会影响该生物对H₂的亲和力。显然需要对纯化的蛋白质进行生化和生物物理研究，以深入了解Hyd1和Hyd2的高亲和力活性、耐氧性和氧化还原伴侣。

致谢

我们感谢Laura Hesse、Melanie Klose和Peter Klaus出色的技术建议和支持；感谢Philippe Constant博士、Peter Janssen博士、Sergio Morales博士、Oliver Lenz教授、Caspar Schafer、Frank Sargent教授和Alison Parkin博士的有益讨论；以及匿名审稿人提供的建设性反馈。这项工作得到了新西兰皇家学会的Marsden资助、奥塔哥大学的奥塔哥研究生奖学金以及新西兰皇家学会的James Cook研究奖学金的财政支持。C.G.前往马克斯·普朗克陆地微生物研究所的差旅费由Professor Sandy Smith纪念奖学金、Maurice and Phyllis Paykel信托基金和奥塔哥大学资助。