摘要


在地球低层大气中，H₂以痕量浓度存在（0.53 ppmv / 0.40 nM），并且周转迅速（寿命 ≤ 2.1 年）。据认为，土壤微生物，很可能是放线菌，是对流层H₂的主要全球汇。然而，从未有任何研究明确证明氢化酶能够氧化这种痕量气体。在这项工作中，我们通过遗传剖析和灵敏的气相色谱测量证明，土壤放线菌 耻垢分枝杆菌 mc²155 组成型地氧化亚对流层浓度的H₂。我们展示了两种膜相关的、依赖氧的[NiFe]氢化酶介导了这一过程。氢化酶-1 (Hyd1)（MSMEG_2262-2263）能很好地适应在不同浓度范围内快速氧化H₂ [Vmax(app) = 12 nmol·g⁻¹·dw⁻¹·min⁻¹；Km(app) = 180 nM；Δhyd23（仅含Hyd1）菌株的阈值为130 pM]，而Hyd2（MSMEG_2719-2720）催化一个更慢速、更高亲和力的过程 [Vmax(app) = 2.5 nmol·g⁻¹·dw⁻¹·min⁻¹；Km(app) = 50 nM；Δhyd13（仅含Hyd2）菌株的阈值为50 pM]。这些观察结果有力地支持了先前将第5组[NiFe]氢化酶（例如Hyd2）与土壤生态系统中对流层H₂氧化联系起来的研究。我们进一步揭示，第2a组[NiFe]氢化酶（例如Hyd1）也能参与此过程。在碳限制的细胞中，氢化酶的表达和活性增加，表明清除痕量H₂有助于维持休眠状态。我们提出了Hyd1和Hyd2在这种条件适应过程中的不同生理作用。拥有高亲和力氢化酶的土壤生物可能特别具有竞争力，因为它们在不稳定的环境中能够利用一种高度可靠的燃料来源。


引言


尽管氢是宇宙中最基本且最丰富的元素，但H₂在地球大气中仅以痕量浓度存在。分子氢的生物地球化学循环导致对流层H₂快速周转（寿命=1.4-2.1年）并将其水平维持在较低的稳态浓度（0.53 ppmv / 0.40 nM）。众所周知，地球化学和人为过程负责了大部分净H₂的产生。生物过程的作用更为复杂。由于种内和种间的氢循环，大多数微生物的H₂氧化和H₂产生过程是平衡的，因此对全球氢预算的净贡献很小或为零。尽管如此，几十年来人们已知土壤生态系统可以通过一个明显的酶促过程氧化对流层H₂。这一至关重要的生态过程估计占对流层H₂净损失的80%。然而，负责的酶仍有待确定。


对土壤样品的气相色谱和氚交换测量表明，土壤对H₂的氧化是一个双相过程，包含低亲和力（Km > 1,000 nM）和高亲和力（Km = 10-70 nM）两种活性。这些活性被认为是由[NiFe]氢化酶催化的，该类酶有五个在系统发育和功能上明确的组别。有人提出第5组[NiFe]氢化酶负责链霉菌中的高亲和力H₂氧化。编码这个新发现的氢化酶谱系（hhyLS）的基因高度保守且在分类学上受限；在已测序的基因组中，这种氢化酶仅广泛存在于环境放线菌中，包括链霉菌属、分枝杆菌属、红球菌属和弗兰克氏菌属的物种。然而，这些酶负责所观察到活性的证据是相关性的且有些矛盾。高亲和力氢化酶活性从未被明确确定过，例如通过纯化蛋白质或进行基因敲除。此外，许多携带hhySL基因的生物只具有低到中等亲和力的H₂氧化活性。而且，最近从β-变形菌门 富养罗尔斯通氏菌 纯化的第5组[NiFe]氢化酶是一种低亲和力、低活性的酶。


我们的实验室使用 耻垢分枝杆菌 作为模型生物来研究土壤放线菌中的氢代谢。这种腐生、不产孢的细菌以其在碳源和氧气变得有限时能在非复制状态下存活的能力而闻名。该生物表达三种系统发育不同的[NiFe]氢化酶：氢化酶-1（Hyd1；MSMEG_2262-2263）、氢化酶-2（Hyd2；MSMEG_2719-2720）和氢化酶-3（Hyd3；MSMEG_3928-3932）。已知第2a组[NiFe]氢化酶Hyd1和第5组[NiFe]氢化酶Hyd2能氧化H₂。它们在指数生长期表达水平较低，并在碳或氧限制期间显著上调。相比之下，第3b组酶Hyd3（MSMEG_3928-3932）预计能将NADPH氧化与H₂产生偶联起来，并在氧限制下由休眠反应调节因子DosR诱导。所有这三种氢化酶的同源物在其他放线菌中也有分布。在本研究中，为了确认高亲和力H₂氧化的决定因素，我们比较了 耻垢分枝杆菌 mc²155及其氢化酶无标记敲除菌株的H₂摄取动力学。我们最终确认Hyd1和Hyd2可以氧化对流层H₂，并具有不同但重叠的特性。


材料与方法


细菌菌株和生长条件


本研究中使用的所有细菌菌株列于表S1。耻垢分枝杆菌 mc²155及其衍生突变体保存在补充有0.05%（wt/vol）泰洛沙泊的溶菌肉汤琼脂平板上。对于液体培养，耻垢分枝杆菌 在37°C下于改良的Hartmans-de Bont基础培养基中培养，该培养基补充有25 mM甘油、0.05%泰洛沙泊和10 μM NiSO₄。培养物在37°C下以200 rpm振荡孵育，直至达到碳限制（30 mL培养基置于125 mL通气烧瓶中）或氧限制（30 mL培养基置于120 mL橡胶塞密封血清瓶中）。对于分级研究，将培养物培养至碳限制状态（750 mL培养基置于2,500 mL通气烧瓶中）。所有培养物的接种初始光密度为0.05。使用Jenway 6300分光光度计在600 nm处测量光密度以评估生长。将培养物在0.85%盐水中稀释，以使在1 cm光程比色皿中测量时的OD₆₀₀低于0.5。为了计算每毫升的菌落形成单位，将培养物在PBS溶液（pH 7.0）中系列稀释并涂布到琼脂平板上。


气相色谱测量


为了测量高亲和力H₂摄取，将 耻垢分枝杆菌 mc²155及其衍生物的碳限制培养物注入含有30 mL补充了0.05%泰洛沙泊的Hartmans-de Bont培养基的血清瓶中，使其密度达到3 x 10⁷ cfu·mL⁻¹（OD₆₀₀ = 0.4）。向顶空中加入标准H₂气体以获得约6.3 ± 0.7 ppmv H₂的初始混合比。通过气相色谱法测量混合比随时间的变化。使用气密注射器抽取250 μL顶空空气等分试样，并加载到Trace Analytical还原气体分析仪上。血清瓶持续振荡以增强H₂从气相到液相的转移。初步测试表明，H₂消耗量与细胞数量成正比，因此不受气体转移的限制。对于Vmax测定，在添加纯H₂气体至初始混合比为500、1000和2000 ppmv后，测量H₂摄取的速率。如前所述，通过将Vmax除以一级速率常数k来估算Km。还在指数生长期的细胞中测量了H₂摄取的动力学。所有实验均使用三个生物学重复进行。为避免气体积累，血清瓶仅在高压灭菌后才用橡胶塞密封。在每次时间过程之前和期间，通过分析标准H₂气体来评估测量的可重复性。


细胞组分的制备


将 耻垢分枝杆菌 mc²155及其衍生物分级为膜和胞质溶胶。将培养物通过离心收集，用PBS溶液洗涤，并重悬于裂解缓冲液中。将混合物孵育并通过细胞破碎仪处理。通过离心除去未破碎的细胞后，将粗细胞裂解液超速离心，得到胞质溶胶（上清液）和膜（沉淀）。使用BCA方法针对BSA标准品测量粗细胞裂解液、胞质溶胶和膜的蛋白质浓度。


天然聚丙烯酰胺凝胶上的活性染色


将来自每个细胞组分的5 μg蛋白质样品上样到两块天然的7.5%（wt/vol）聚丙烯酰胺凝胶上。两块凝胶同时在Tris-甘氨酸缓冲液中电泳。一块凝胶用考马斯亮蓝染色以显示总蛋白。另一块凝胶在含有0.5 mM硝基蓝四唑氯化物的50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中进行氢化酶活性染色（H₂-硝基蓝四唑氧化还原酶活性）。将样品在富含氢的气氛中的厌氧培养箱内孵育过夜。


电流分析法测量氢气


如前所述，使用电流分析法测量细胞组分的氢化酶活性。将饱和H₂的PBS溶液、饱和O₂的PBS溶液和稀释的细胞组分引入并搅拌到一个0.9 mL的分析室中。使用Unisense优尼森 H₂-MR氢微传感器，在+800 mV极化下测量H₂浓度随时间的变化。根据制造商的说明进行校准。在观察到H₂浓度线性变化后，计算20秒内的初始速率，并归一化至蛋白质浓度。


分类学分析


从国家生物技术信息中心数据库中检索了所有已测序基因组中预测的第2a组、第5组和第3b组[NiFe]氢化酶的大亚基蛋白序列。为了检索，使用来自 耻垢分枝杆菌 的三种[NiFe]氢化酶的大亚基作为Blast局部比对搜索工具的参考序列。通过检查每条序列的N端L1和C端L2特征基序来验证分类。