3.6. MANPs-PTX在体内增强的放化疗效果

为了确定MANPs-PTX在体内的肿瘤生长抑制作用，将荷CT26肿瘤的小鼠随机分为八组，包括载体、MnO₂-HSA、ANPs-PTX和MANPs-PTX，伴或不伴X射线放射治疗。结果表明，单独的MnO₂-HSA在治疗期间并未抑制肿瘤生长，其肿瘤生长曲线与载体治疗组重合。随后，单独的化疗仅显示出轻微的肿瘤生长抑制作用。与载体+RT治疗相比，ANPs-PTX+RT治疗显示出轻微的肿瘤抑制效果，但差异不显著。在MnO₂-HSA+RT组中，观察到对肿瘤生长有明显的抑制作用，这可能是由于MnO₂-HSA在肿瘤区域产生氧气，导致X射线辐射后DNA损伤增加。重要的是，MANPs-PTX+RT治疗在所有治疗中显示出最显著的肿瘤生长延迟，抑制率达到96.57%。这些结果表明，沉积在ANPs-PTX上的MnO₂可以显著提高放化疗的治疗效果（图7a和S8）。类似地，肿瘤切片的H&E染色显示，MANPs-PTX+RT治疗诱导了显著的肿瘤坏死区域和细胞核分散。相比之下，载体+RT或ANPs-PTX+RT治疗后只有少数破坏区域，其中癌细胞紧密排列，细胞核浓缩，表明治疗效果不足（图7c）。同时，MANPs-PTX与其他辐照组之间的体重没有差异，表明MANPs-PTX在治疗期间的初步安全性（图7b）。

[图7：(a) 不同治疗组小鼠的肿瘤生长曲线。(b) 治疗期间各组小鼠的体重变化曲线。(c) 不同治疗组肿瘤组织的H&E染色、TUNEL染色和Ki67免疫组化染色图像。(d) TUNEL阳性细胞（凋亡细胞）的定量分析。(e) Ki67阳性细胞（增殖细胞）的相对百分比定量分析。]


我们接下来通过放化疗后24小时肿瘤组织的TUNEL染色评估了凋亡细胞。载体+RT治疗仅在肿瘤组织内引起零星的红色免疫荧光。这意味着放疗的治疗效果受到缺氧微环境的大大限制。在MnO₂-HSA+RT组中，与载体+RT治疗相比，红色免疫荧光广泛出现。这表明MnO₂-HSA+RT诱导了更多的凋亡细胞，这可能是由于氧气的产生。此外，MANPs-PTX+RT显示出比其他三组高得多的荧光信号，这表明其具有最佳的治疗效果（图7c，d）。


Ki-67（高度增殖性肿瘤细胞的生物标志物）的免疫组织化学染色表明，MANPs-PTX+RT导致肿瘤增殖显著延迟。单独RT组中Ki67阳性细胞的百分比设为100%。ANPs-PTX+RT组与单独RT组之间Ki67+细胞的相对百分比没有显著差异，其中Ki67抗体的棕色染色与细胞核大部分共定位良好。然而，MANPs-PTX+RT治疗仅显示少量Ki67阳性细胞，表明具有显著的肿瘤抑制效果（图7c，e）。


3.7. MANPs-PTX的体内毒性测试

通过正常组织切片和血清生化分析进行了体内毒性测试。体内治疗试验结束后，处死小鼠，分别收集血液和主要器官。图8a的H&E染色结果表明，与载体+RT组相比，所有小鼠的主要器官均未观察到可观察到的损伤。此外，主要的肝功能标志物包括天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶表明，MANPs-PTX治疗后对肝功能没有明显影响。肾功能标志物也表明MANPs-PTX在肾功能方面未诱导明显的毒性。未发现溶血现象，因为直接胆红素、总胆红素以及DB/TB比值的数据在MANPs-PTX和其他三组之间没有差异。急性毒性数据也显示MANPs-PTX对肝脏和肾脏没有明显的毒性，这进一步证实了我们制备的纳米颗粒的生物安全性。

[图8：(a) 不同治疗组小鼠主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色图像。(b) 血清中AST水平的定量分析。(c) 血清中ALT水平的定量分析。(d) 血清中BUN水平的定量分析。(e) 血清中DB水平的定量分析。(f) 血清中TB水平的定量分析。(g) DB/TB比值的定量分析。]


4. 讨论


我们首次通过简便的一步氧化法开发了功能化的白蛋白结合型紫杉醇纳米颗粒，以增强放化疗效果。随着KMnO₄加入到ANPs-PTX悬浮液中，纳米颗粒的平均直径逐渐增加，这表明MnO₂沉积在ANPs-PTX的表面。当MnO₂/PTX的重量比达到1.5:1时，制备的悬浮液变得浑浊，这是由于颗粒聚集所致。综合评估MANPs-PTX的特性（包括稳定性、尺寸分布和MnO₂负载量）后，在后续研究中选择了0.5:1的MnO₂/PTX比例。在优化条件下，MANPs-PTX的平均直径比ANPs-PTX增加了约30 nm。此外，MANPs-PTX粗糙的表面与光滑的ANPs-PTX显著不同，这可能是由于随机的MnO₂沉积所致。高分辨率TEM图像也显示了与其他研究相似的MnO₂晶格信息。此外，HPLC分析表明，KMnO₄氧化对ANPs-PTX中紫杉醇含量的影响不明显且可接受。MANPs-PTX的所有这些特性表明，通过我们简便的制备方法成功实现了MnO₂的沉积。


此外，ANPs-PTX表面的轻微修饰对肿瘤细胞的细胞内吞作用没有观察到明显影响，其主要依赖于网格蛋白和小窝蛋白介导的途径。细胞内吞后，MANPs-PTX主要分布在细胞溶酶体中。在酸性pH和过量H₂O₂存在下，MnO₂被还原为Mn²⁺，同时产生大量氧气。此外，PTX同时逐渐释放，其释放速率与ANPs-PTX相似。结合释放的PTX，氧气的产生固定了DNA损伤并使更多肿瘤细胞停滞在G2/M期，从而显著改善了放化疗效果。同时，MANPs-PTX显著抑制了缺氧标志物的表达，后者在调节包括增殖、血管生成和能量代谢在内的多种生物功能中起着核心作用。


我们先前的研究表明，白蛋白结合型紫杉醇纳米颗粒与我们的ANPs-PTX在结构、治疗效果和安全性方面没有观察到显著差异。临床上，Abraxane联合放疗的效果有限，这归因于具有酸性pH和过量H₂O₂的复杂肿瘤微环境。因此，我们制备功能化ANPs-PTX的简便方法也适用于Abraxane以改善放化疗效果。鉴于它们相似的结构和组成，可以确保安全性。


如前所述，MANPs-PTX可以被视为新型的功能化纳米颗粒，它可以将肿瘤区域过量的H₂O₂转化为氧气。我们的MANPs-PTX将是一种有前景的增强放化疗效果和肿瘤成像的制剂，其安全性也得到了很好的保障。


5. 结论


在这项研究中，我们开发了新型的功能化ANPs-PTX以改善放化疗，其制备过程通过一步氧化法十分简便。MANPs-PTX的MnO₂壳层会与酸性pH下过量的H₂O₂反应，在肿瘤区域持续产生氧气。肿瘤氧合可以克服缺氧微环境，从而改善放化疗效果。此外，释放的Mn²⁺离子具有优异的T1-MRI性能，可用于肿瘤检测。同时，MANPs-PTX的安全性也得到了很好的保障。总之，MANPs-PTX将是一种有前景的结直肠癌治疗诊断剂。