3.2. MANPs-PTX的细胞摄取和体外增强放疗效果

根据流式细胞术检测的时间依赖性细胞摄取，在细胞内运输实验中选择4小时的孵育时间。使用激光扫描共聚焦显微镜研究了MANPs-PTX/香豆素6的细胞内运输。孵育4小时后，MANPs-PTX/香豆素6与溶酶体标记物Lysotracker Red大量共定位，共定位Pearson's R值为0.89。图3b表明CT26细胞对MANPs-PTX的摄取是能量依赖的，因为在4°C时MANPs-PTX的荧光被抑制了94.85%。此外，Dynasore、氯丙嗪和甲基-β-CD对MANPs-PTX的摄取均有显著抑制作用。结果表明，MANPs-PTX的细胞摄取主要由网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞途径共同介导（图3b）。

[图3：(a) 激光共聚焦显微镜图像，显示MANPs-PTX/香豆素6（绿色）与溶酶体（红色）共定位。(b) 不同抑制剂及低温处理对CT26细胞摄取MANPs-PTX的影响。(c) CT26细胞对MANPs-PTX的时间依赖性摄取流式图。(d) 不同处理条件下CT26细胞的存活率。(e) 不同处理后CT26细胞的TUNEL荧光染色图像。(f) TUNEL荧光的定量分析。]


在细胞毒性实验中，我们用石蜡覆盖贴壁的肿瘤细胞以模拟缺氧微环境。为了确定MANPs-PTX增强的放化疗效率，我们首先检测了不同浓度MnO₂-HSA对CT26细胞的细胞毒性。尽管MnO₂-HSA的浓度高达50 μM，但未显示出明显的细胞毒性，这表明沉积在白蛋白或ANPs-PTX上的MnO₂对细胞或组织是无毒的。接下来，我们分别用载体、MnO₂-HSA、ANPs-PTX和MANPs-PTX处理细胞，伴或不伴X射线辐射。经过ANPs-PTX处理后，细胞活力降至77.1%，显著低于阴性对照组。这意味着在化疗中，即使在缺氧微环境下，紫杉醇也能明显抑制细胞增殖。然而，与载体+RT组相比，ANPs-PTX+RT组在同等PTX剂量下仅略有优势。此外，结果显示，MANPs-PTX+RT组表现出比单独化疗组更好的治疗效果，细胞活力分别为23.4%和44.9%。同时，MANPs-PTX+RT组的细胞活力显著低于MnO₂-HSA+RT组和单纯RT组，这表明MANPs-PTX在改善放化疗方面具有优越性（图3d）。


为了检测放化疗诱导的细胞凋亡，用不同处理方法进行了TUNEL检测。与获得的细胞毒性结果相似，用MANPs-PTX+RT处理的CT26细胞在细胞核周围显示出广泛的红色荧光，而用载体+RT或ANPs-PTX+RT处理的细胞在TUNEL染色中仅显示出可忽略的荧光（图3e）。TUNEL荧光的定量分析表明，与ANPs-PTX+RT相比，MANPs-PTX在增强放疗方面具有更好的治疗效果，导致更多的凋亡细胞（图3f）。


3.3. MANPs-PTX的体内生物分布

为了追踪体内的MANPs-PTX，我们在制备过程中将IR775封装到MANPs-PTX中。如图4a所示，肿瘤区域的荧光逐渐增强，表明纳米颗粒在注射后48小时内显著积聚在肿瘤中。近红外荧光从48小时到96小时逐渐减弱，这可能是由于肿瘤组织内MANPs-PTX/IR775的代谢所致。我们之前的工作表明，游离的IR775在静脉注射后不会在肿瘤区域积聚。图4c和4d的结果显示，注射后8小时，肿瘤组织中的近红外荧光信号明显强于正常组织。

[图4：(a) 静脉注射MANPs-PTX/IR775后不同时间点的小鼠活体近红外荧光成像图。(b) 肿瘤区域荧光强度随时间变化的定量分析。(c) 注射后8小时离体器官和肿瘤的近红外荧光成像图。(d) 离体器官和肿瘤荧光强度的定量分析。]


3.4. MANPs-PTX对体外和体内T1加权MR信号的影响

沉积在ANPs-PTX表面的MnO₂可以在肿瘤酸性pH和富含H₂O₂的微环境中释放Mn²⁺。释放的Mn²⁺将大大提高肿瘤成像的T1-MRI性能。在静脉注射MANPs-PTX后0、8、24和48小时，获得了荷CT26肿瘤小鼠肿瘤区域的MRI图像。在注射前，MANPs-PTX和ANPs-PTX之间没有显著差异，而从注射后8小时开始，注射MANPs-PTX后肿瘤区域的信号强度明显增加。这些结果与MANPs-PTX体内生物分布的动态荧光信号变化一致。注射后48小时，肿瘤区域变暗，这可能是由于Mn²⁺逐渐清除所致。结果表明，MANPs-PTX可以在肿瘤区域积聚，在那里它与过量的H₂O₂反应产生Mn²⁺，从而实现优异的肿瘤MR成像。

[图5：(a) 静脉注射MANPs-PTX前后不同时间点的荷瘤小鼠T1加权MR图像。(b) 肿瘤区域信噪比的定量分析。(c) 肿瘤区域对比度增强率的定量分析。(d) MANPs-PTX和ANPs-PTX与不同浓度H₂O₂反应后的T1加权MR幻影图像。(e) MANPs-PTX和ANPs-PTX的纵向弛豫率r1值拟合曲线。]


MANPs-PTX和ANPs-PTX在不同浓度H₂O₂（pH 6.8 PBS）中反应的T1-MR图像如图5d所示。随着H₂O₂浓度的增加，MANPs-PTX溶液的幻影图像强度逐渐增加。MANPs-PTX的纵向弛豫率r1值测定为2.34 mM⁻¹·s⁻¹，远高于ANPs-PTX的0.13 mM⁻¹·s⁻¹（图5d，e）。


3.5. MANPs-PTX在体内的H₂O₂消耗和氧气生成

图6a表明，在CT26肿瘤中瘤内注射MANPs-PTX导致H₂O₂浓度显著降低。这意味着沉积在ANPs-PTX表面的MnO₂能够有效消耗过量的H₂O₂。同时，将Clark氧电极插入经ANPs-PTX或MANPs-PTX处理的肿瘤组织中检测氧浓度。在瘤内注射前，两个肿瘤中的氧浓度均达到平衡。注射50 μL ANPs-PTX后，氧浓度保持稳定，因为几乎没有氧气产生。然而，注射的MANPs-PTX能与酸性pH下的H₂O₂反应，产生大量O₂，其在注射后5分钟的浓度高达约50 μM（图6b）。

[图6：(a) 瘤内注射ANPs-PTX或MANPs-PTX后肿瘤组织中H₂O₂的含量。(b) 瘤内注射ANPs-PTX或MANPs-PTX后肿瘤组织内氧气浓度的实时变化曲线。(c) 不同处理后肿瘤组织的HIF-1α免疫荧光染色图像。(d) HIF-1α荧光强度的定量分析。]


我们接下来通过免疫荧光实验研究了MANPs-PTX对体内肿瘤缺氧的影响。MnO₂-HSA和MANPs-PTX处理均显示出比载体和ANPs-PTX处理明显更弱的免疫荧光（图6c）。图6d的定量结果表明，与载体处理相比，MANPs-PTX处理后HIF-1α的表达下降了58.93%。上述所有结果表明，MANPs-PTX可以有效改善肿瘤氧合，这将调节缺氧的肿瘤微环境。