2.5. 细胞毒性和细胞内摄取

CT26细胞在补充有10% FBS和1%青霉素/链霉素的1640培养基中培养，条件为37°C、5% CO₂。为了检测细胞毒性，将CT26细胞以每孔5 x 10³个细胞的密度接种到96孔板中。贴壁后，用石蜡覆盖细胞12小时。通过覆盖的液体石蜡膜将培养基与常氧气氛分离，为肿瘤细胞提供缺氧环境。然后，分别用载体、MnO₂-HSA、ANPs-PTX、MANPs-PTX孵育CT26细胞12小时。在液体石蜡膜下方加入不同的溶液。辐射效率设置为3 Gy/min，辐射持续100秒。辐射后，移除不同处理，并将CT26细胞继续培养72小时。向每个孔中加入由CCK-8和新鲜培养基组成的混合溶液，再孵育2小时。最后，使用酶标仪在450 nm处测量吸光度。以载体处理的细胞作为对照。


为了检测细胞内摄取，将CT26细胞以每孔1 x 10⁵的密度接种在六孔板中。分别用MANPs-PTX/香豆素6处理细胞0、1、2、4和8小时。移除药物后，胰蛋白酶消化CT26细胞，并通过流式细胞术进行分析。


为了研究内吞途径，在用MANPs-PTX/香豆素6于37°C孵育4小时前，先用不同的抑制剂预处理CT26细胞0.5小时。同时，将CT26细胞与MANPs-PTX/香豆素6在4°C下孵育，以确定MANPs-PTX的细胞摄取是否能量依赖。使用FLOWJO分析内吞实验中的香豆素6荧光。


2.6. MANPs-PTX的细胞内运输

将CT26细胞以每孔7 x 10⁴个细胞的密度接种在铺有玻璃片的24孔板中。贴壁后，用MANPs-PTX/香豆素6孵育细胞4小时。使用溶酶体标记物Lysotracker Red和DAPI分别标记CT26细胞的溶酶体和细胞核。用PBS洗涤细胞两次。使用Olympus FV3000激光扫描共聚焦显微镜获取和分析图像。


2.7. 动物和CT26移植瘤模型

雄性Balb/c小鼠购自扬州大学医学中心，并按照南京大学动物护理和使用委员会的指导进行护理。首先通过在小鼠侧腹皮下注射5 x 10⁶个CT26细胞悬液来建立CT26肿瘤。十四天后，分离肿瘤块并将其切成约2 mm³的小块，将其皮下植入小鼠右腋窝以建立CT26结肠癌模型。


2.8. MANPs-PTX的体内成像

为了确定MANPs-PTX在CT26结肠癌模型中的分布情况，将近红外染料IR775封装在MANPs-PTX中以获得MANPs-PTX/IR775。使用IVIS Lumina成像系统检测体内IR775荧光信号。通过尾静脉注射用MANPs-PTX/IR775处理荷瘤小鼠。将麻醉小鼠置于37°C的动物板上，并在注射后15分钟至96小时捕获图像。对于组织分布测定，在注射后8小时处死小鼠，分离主要器官并以类似于全动物成像的方式进行测定。使用IVIS Living Imaging软件分析数据。


2.9. MR成像特性测量

为了研究MANPs-PTX在体外和体内对T1加权MR信号的影响，在MR扫描仪上进行T1弛豫率表征和T1加权成像。通过尾静脉注射用MANPs-PTX处理荷瘤小鼠。将麻醉小鼠固定在动物槽中，并在0至48小时内获取图像。


对于体外检测，用不同浓度的H₂O₂预处理MANPs-PTX 30分钟。记录T1幻影图像和T1弛豫时间。使用Nikon NIS-Elements和ImageJ软件分析幻影图像。


2.10. 体内氧气生成和过氧化氢消耗

当肿瘤体积达到约350 mm³时，向荷瘤小鼠瘤内注射MANPs-PTX或等量ANPs-PTX。为了研究MANPs-PTX的氧气生成，使用Clark氧电极进行持续监测以测量肿瘤组织内的氧浓度。用腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠并固定在操作台上。将带有精细控制升降装置的Clark氧电极小心地插入肿瘤组织中。在瘤内注射50 μL MANPs-PTX或ANPs-PTX之前，让氧电极平衡几分钟。然后自动记录氧浓度。


对于H₂O₂消耗的检测，分别在瘤内注射50 μL MANPs-PTX或ANPs-PTX后30分钟处死小鼠。分离肿瘤组织并称重。加入组织裂解液并使用IKA-Ultra Turrax T25匀浆机进行匀浆。将悬浮液离心。根据制造商的指南，使用过氧化氢检测试剂盒检测上清液，所有步骤均在4°C下进行。


2.11. MANPs-PTX增强的体内放化疗

当Balb/c小鼠的肿瘤体积达到约70-100 mm³时开始治疗。将小鼠分为八组，分别用载体、MnO₂-HSA、ANPs-PTX和MANPs-PTX处理，伴或不伴辐射。所有样品均通过尾静脉给药，X射线放射治疗在静脉注射后8小时进行。治疗在第0天和第7天各进行一次。每隔一天记录肿瘤大小和体重。肿瘤体积根据以下公式计算：宽度² × 长度 / 2。在处死前收集血液用于血清生化检测。使用Chemray 430测量血清生化数据。同时，根据制造商的说明，在第15天对处死小鼠的主要器官和肿瘤进行苏木精和伊红染色。


[图3：显示实验分组和治疗方案的示意图。包括对照组、MnO₂-HSA组、ANPs-PTX组、MANPs-PTX组，以及各自联合放疗（5 Gy）的组合。]


2.12. 免疫荧光和免疫组织化学

为了确定肿瘤缺氧情况，使用兔单克隆HIF-1α抗体对HIF-1α进行染色。用于HIF-1α染色的肿瘤组织来自静脉注射载体、MnO₂-HSA、ANPs-PTX和MANPs-PTX后12小时处死的小鼠。HIF-1α抗体用3% BSA封闭缓冲液按1:200稀释后使用，DAPI用于标记细胞核。


为了评估放化疗的增强效果，分别使用TUNEL检测试剂盒和兔单克隆Ki67抗体对凋亡细胞和增殖细胞进行染色。通过静脉注射不同样品处理小鼠，12小时后进行放射治疗。在放疗处理后24小时处死小鼠制备肿瘤切片。对于Ki67免疫组织化学，将兔抗Ki67一抗按1:200稀释，将山羊抗兔二抗（与辣根过氧化物酶偶联）按1:5000稀释。DAB显色时间设定为载体+RT组肿瘤切片出现大量沉淀的时间，控制在8分钟内。所有TUNEL检测程序均遵循制造商的说明。使用Nikon Eclipse Ti显微镜捕获图像，并使用Nikon NIS-Elements进行分析。


2.13. 统计分析

两组间的统计显著性采用双尾Student t检验，多组间比较采用单因素方差分析。p值小于0.05被认为具有统计学显著性。


3. 结果


3.1. MANPs-PTX的表征

通过调整ANPs-PTX中PTX与MnO₂的重量比来优化制备程序。同时评估了粒径、稳定性和MnO₂负载量。最终选择了1:0.5（w:w）的比例，因为在此比例下MANPs-PTX具有最合适的尺寸分布和丰富的MnO₂沉积。通过记录紫外-可见吸收光谱进一步确认了MnO₂的沉积。所得的MANPs-PTX平均粒径分布约为140 nm，相较于ANPs-PTX略有增加。由于MnO₂的沉积，溶液颜色从淡蓝色变为棕色。MANPs-PTX的Zeta电位为-30.3 mV，而ANPs-PTX和MnO₂-HSA的Zeta电位分别为-21.8和-32.6 mV。透射电子显微镜图像显示，ANPs-PTX具有光滑表面的球形结构，整个颗粒未观察到晶格条纹。然而，MnO₂沉积在ANPs-PTX表面导致表面粗糙。高分辨率TEM图像还显示了晶格间距为0.24 nm的晶格条纹。图2d显示，随着H₂O₂浓度的增加，MANPs-PTX的紫外-可见吸光度逐渐降低。这表明在酸性介质中，H₂O₂可以将MANPs-PTX表面的MnO₂还原为无色的Mn²⁺离子，导致MnO₂逐渐减少。

[图2：(a) ANPs-PTX和MANPs-PTX的粒径分布图。(b) ANPs-PTX和MANPs-PTX的Zeta电位图。(c) MANPs-PTX的TEM图像，插图为高分辨TEM图像，显示0.24 nm的晶格条纹。(d) MANPs-PTX与不同浓度H₂O₂反应后的UV-vis吸收光谱变化。(e) 连续添加H₂O₂后，MANPs-PTX和ANPs-PTX的产氧曲线。(f) MANPs-PTX反复注入H₂O₂后，累积产氧量与剩余H₂O₂浓度的关系图。]


为了确定MANPs-PTX产生氧气的能力，使用氧电极（丹麦Unisense  优尼森）监测O₂的产生。如图2e所示，与等量的ANPs-PTX相比，MANPs-PTX与100 μM H₂O₂反应，每10分钟可持续产生显著的氧气。此外，在另一个测试系统中进一步证实了H₂O₂消耗与氧气生成之间的相反关系，其中将MANPs-PTX反复注入200 μM H₂O₂中。结果表明，随着剩余H₂O₂的减少，产生了大量的氧气。氧气的产生归因于H₂O₂还原了MANPs-PTX表面的MnO₂（图2f）。