摘要： 具有缺氧和过量过氧化氢特征的肿瘤微环境极大地限制了结直肠癌的放化疗效果。我们首次开发了一种简易方法，将二氧化锰沉积在白蛋白结合型紫杉醇纳米颗粒的表面，以获得功能化的MANPs-PTX。在肿瘤微环境中，MANPs-PTX可以消耗过量的过氧化氢产生大量氧气用于肿瘤增氧，从而改善放化疗效果。同时，从MANPs-PTX释放的Mn²⁺具有优异的T1磁共振成像性能，可用于肿瘤检测。值得注意的是，所获得的MANPs-PTX将是一种有前途的治疗诊断剂，并具有潜在的临床应用前景。


1. 引言


结直肠癌是全球第三大常见癌症，约有一半的患者在五年内死于该病。目前晚期结直肠癌的治疗，包括化疗和放疗在内的单一疗法并不总能成功，这会导致远处转移、耐药和局部复发。因此，放疗联合化疗引起了基础研究和临床实践的极大兴趣。


在众多的化疗药物中，紫杉醇是与放疗联合最有前景的候选药物之一，这归功于其将细胞周期阻滞在G2/M期的显著效果。同时，白蛋白结合型紫杉醇纳米颗粒（ANPs-PTX，2005年FDA批准）的开发旨在维持紫杉醇的治疗优势，同时避免聚氧乙基化蓖麻油相关的毒性。从某种意义上说，ANPs-PTX是传统紫杉醇化疗药物的优越替代品，用于放化疗。


然而，肿瘤微环境的特征性异常，即缺氧和过量的活性氧如H₂O₂（~100 μM），极大地限制了结直肠癌的放化疗疗效。与正常细胞相比，已广泛检测到升高的ROS水平，这主要是由于多种癌细胞线粒体中快速的代谢。此外，一些研究也表明，放射治疗或化疗会产生大量的ROS，包括H₂O₂。值得注意的是，肿瘤区域过量的H₂O₂可以通过抑制脯氨酰羟化酶来稳定缺氧诱导因子-1α，从而导致负责癌细胞增殖和存活的多种基因表达。因此，降低肿瘤H₂O₂水平可能有利于癌症治疗的效果。同时，缺氧也会抑制PHD活性，导致HIF-1α亚基稳定并与细胞核中的HIF-1β识别，进行进一步的遗传转录。此外，缺氧的肿瘤细胞对放射治疗产生抵抗，而氧分子能够固定辐射诱导的DNA损伤，从而阻止受损DNA的修复。同时，增加肿瘤氧合也可以使更多的肿瘤细胞停滞在对所有细胞周期阶段中最具放射敏感性的G2/M期。而且，增加肿瘤氧合将显著改善癌症治疗。


因此，如果能将过量的H₂O₂转化为氧气，将在肿瘤放化疗期间获得显著益处。最近，已经探索了一些用于这种转化的策略，包括递送过氧化氢酶、二氧化锰和普鲁士蓝纳米颗粒。值得注意的是，MnO₂对酸性pH和H₂O₂具有高反应性和特异性，能够同时且持续地产生氧气以克服肿瘤缺氧。同时，由MnO₂产生的Mn²⁺是一种强效的T1磁共振造影剂，用于肿瘤检测。MnO₂的多重益处被考虑与ANPs-PTX结合，以改善结直肠癌的放化疗。


在我们的研究中，我们旨在开发一种简便的方法来制备功能化的ANPs-PTX。受将MnO₂沉积到氧化石墨烯和白蛋白上的过程的启发，我们首先通过简单的氧化制备方法将二氧化锰沉积在白蛋白结合型紫杉醇纳米颗粒的表面，以获得功能化的MANPs-PTX。然后，我们详细检测了所得MANPs-PTX的特性，包括粒径、Zeta电位、形态和氧气生成能力。静脉注射后，MANPs-PTX可通过EPR效应在肿瘤区域积聚，并响应肿瘤微环境（包括过量的H₂O₂和酸性pH）释放Mn²⁺、氧气和紫杉醇。大量氧气的产生可以克服肿瘤缺氧，从而有效增强放化疗的治疗效果。同时，释放的Mn²⁺具有优异的T1-MRI性能，可用于肿瘤成像。此外，MANPs-PTX对正常组织没有明显的毒性。值得注意的是，通过我们简便方法制备的MANPs-PTX将成为一种有前景的结直肠癌治疗诊断剂（图1）。

图 1. (a) 二氧化锰负载白蛋白结合紫杉醇纳米颗粒（MANPs- PTX）的简便制备示意图；(b) MANPs- PTX 在增强化学放射治疗及肿瘤磁共振成像中的作用机制。


2. 材料与方法


2.1. 材料和试剂

紫杉醇购自江苏红豆杉生物医药公司。KMnO₄购自国药集团化学试剂有限公司。人血清白蛋白、IR-775、香豆素6和细胞摄取抑制剂购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州）。Cell-Counting Kit-8购自Dojindo Laboratories（熊本，日本）。TUNEL检测试剂盒、HIF-1α抗体和Ki67抗体购自Thermo Fisher Scientific（上海，中国）。


2.2. ANPs-PTX、MnO₂-HSA和MANPs-PTX的制备

根据我们之前的报告制备ANPs-PTX。MANPs-PTX通过简便的一步氧化制备方法获得。将KMnO₄溶液（6 mL，2.43 mg/mL）滴加到14 mL ANPs-PTX悬浮液（PTX浓度为1.14 mg/mL）中，在37°C下剧烈搅拌30分钟，形成MANPs-PTX。然后，用蒸馏去离子水透析MANPs-PTX三次，并通过超滤装置浓缩。采用类似方法制备了MANPs-PTX/香豆素6和MANPs-PTX/IR775。


通过将6 mL KMnO₄溶液（1.05 mg/mL）逐滴加入到14 mL HSA悬浮液（3.57 mg/mL）中，在37°C下剧烈搅拌来制备MnO₂-HSA。然后，用蒸馏去离子水透析MnO₂-HSA三次，并以相同方式浓缩以备后用。


2.3. MANPs-PTX的表征

为了测定ANPs-PTX和MANPs-PTX中PTX的浓度，向悬浮液中加入乙腈（体积比9:1），剧烈振荡提取。通过离心收集上清液，并使用高效液相色谱法检测紫杉醇浓度。使用Zetasizer Nano测量纳米颗粒的粒径分布和Zeta电位。使用透射电子显微镜表征MANPs-PTX的形貌和晶格信息。使用紫外-可见分光光度计检测纳米颗粒的紫外-可见光谱。MnO₂的浓度也通过紫外-可见分光光度计使用建立的标准吸收曲线进行测量。为避免蛋白质的影响，选择了400 nm波长。


2.4. 体外氧气生成和过氧化氢消耗

为了确定MANPs-PTX产生氧气的能力，使用了Clark氧电极（丹麦Unisense  优尼森），实现了O₂产生的连续监测。将氧电极浸入MANPs-PTX或等量ANPs-PTX的测试溶液中几分钟以使系统平衡。然后，将100 μM H₂O₂注入测试悬浮液中。监测10分钟后，再进行一次H₂O₂注射，共四个循环。


此外，在另一个测试系统中进一步证实了H₂O₂消耗与O₂生成之间的相反关系。简言之，将MANPs-PTX（10 μM MnO₂）注入100 μM H₂O₂中，记录氧气的产生。重复该过程九次，并计算累积氧气量。此外，根据制造商的说明，使用过氧化氢检测试剂盒测定H₂O₂浓度。