2.4. 珊瑚藻净钙化

在大规模水族箱系统的四周生长期间，使用浮重技术的改进方法测量了每个处理组15块珊瑚藻碎片的骨骼生长速率。


2.5. 丝状草皮藻类的覆盖

使用Coral Point Count软件确定覆盖珊瑚藻碎片的丝状草皮藻类的百分比。这是在四周生长期结束时，从高CO₂+草皮和环境CO₂+草皮处理组中随机选择的12块珊瑚藻碎片的照片进行评估的。


2.6. 扩散边界层内的pH和氧分压

使用pH和氧气微电极测量珊瑚藻碎片表面扩散边界层内的pH和氧分压。将环境CO₂和高CO₂处理组的完整珊瑚藻碎片，或环境CO₂+草皮和高CO₂+草皮处理组中被丝状草皮藻类覆盖的完整珊瑚藻碎片视为独立重复样本，每个处理组分析三个重复样本。对于每个重复，使用显微操纵器和体视显微镜定位电极，在距离珊瑚藻碎片表面10-50 μm处每10秒进行一次微电极测量。对于pH测量，使用100 μm微电极，而氧气测量则使用25 μm微电极；两者均连接到万用表。pH微传感器使用商业缓冲液在20.0°C下校准，该温度代表进行pH测量的恒温室平均温度。氧气微电极在海水中于20.0°C的空气平衡状态下校准，并在零氧条件下使用含0.1 M抗坏血酸钠的碱性溶液校准。


在光照和黑暗条件下测量扩散边界层内的pH和pO₂直至达到平衡。对于干净的珊瑚藻碎片，在完全辐照下测量边界层pH和pO₂ 1小时，接着在黑暗中测量1小时，然后再进行第二次1小时的完全辐照。对于被草皮藻类覆盖的珊瑚藻碎片，为了考虑草皮藻类对扩散边界层内海水化学性质的假设影响，pH和pO₂至少测量9小时，其中4.5小时完全辐照和4.5小时黑暗。由于时间限制，仅对高CO₂+草皮和环境CO₂+草皮处理组各一个重复样本进行了额外的4.5小时完全辐照测量。扩散边界层内的pCO₂是根据温度、盐度、总碱度和总标度pH的测量值，使用CO2SYS程序推导得出，如上所述。微电极测量在一个4升的玻璃水族箱中进行，重复样本安装在一个玻璃基座上。水族箱用12伏白色卤素光源照明，光子通量约为250 μmol光子 m⁻² s⁻¹。


2.7. 氧气平衡：光合作用与暗呼吸

使用带有氧气敏感电极注射口的封闭培养室测定珊瑚藻和草皮藻类在光照和黑暗条件下的氧气平衡，如前所述。两个83 mL的培养室同时运行，使用500 μm氧气微电极连接到万用表，并使用取自环境或高CO₂处理组的海水。对于珊瑚藻，使用完整的干净碎片；对于丝状草皮藻类，将从一块珊瑚藻碎片上取下的大约50 cm³松散堆积的丝状体视为独立重复样本。在光照和黑暗条件下，测量培养室内的pO₂ 0.5-2小时，或者直到每个重复样本的pO₂相对于初始值至少有10%的变化。分析了高CO₂和环境CO₂下珊瑚藻的五个重复样本，以及在高CO₂和环境CO₂下生长的丝状草皮藻类的五个重复样本。培养室用12伏白色卤素光源照明，每个培养室的光子通量约为250 μmol光子 m⁻² s⁻¹。测量期间，培养室浸没在恒温水浴中，保持20.0 ± 0.3°C。


净光合速率和暗呼吸速率计算如下：


其中O₂斜率是培养室内氧气浓度随时间的变化率，V_瓶是培养室的个体体积，Chl a是特定样本的总叶绿素a含量，DM是特定样本的总干质量。对于另外10块珊瑚藻碎片的子样本，确定珊瑚藻碎片的体积为2.05 ± 0.28 cm³，或培养室体积的2.5 ± 0.3%（平均值±1标准误）。因此，对于氧气收支计算，假设培养室中珊瑚藻碎片的体积可以忽略不计。对于每个研究的重复样本，氧气平衡均归一化为叶绿素a含量和干质量。


2.8. 叶绿素a色素分析

所有用于扩散边界层pH和氧气测量以及氧气平衡测量的藻类重复样本，在测量完成后立即存放在-18°C的常规冰箱中。冷冻前，用镊子从珊瑚藻上取下覆盖的草皮藻类并单独存放。然后将所有重复样本在VirTis Benchtop 2K系列冷冻干燥机中干燥4.8天。使用甲醇作为溶剂的紫外分光光度法测定所有样本的总叶绿素a含量。


2.9. 数据分析

使用ANOVA评估丝状草皮藻类和CO₂浓度对珊瑚藻碎片表面扩散边界层内在完全辐照和黑暗条件下pH、pO₂和pCO₂平均范围的影响。进一步使用Tukey HSD事后检验检查处理组均值之间的显著差异。使用嵌套双因素ANOVA评估pCO₂以及丝状草皮藻类的存在对四周生长期间珊瑚藻碎片净钙化的影响，其中pCO₂（环境和高）和丝状草皮藻类水平（存在或不存在）作为固定因子。必要时对数据进行转换以满足正态性和方差齐性的假设，分别通过Shapiro-Wilk检验和Levene检验指示。水族箱系统中的碳酸盐化学参数和温度不符合正态分布，因此分别使用非参数Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis H检验比较处理组之间的差异。所有其他数据在转换后满足正态性和齐性假设。正文和图中的数据以平均值±1标准差表示。