血管密度


荆豆可染色人肺和内源性人胰岛的微血管内皮，但未能染色内源性小鼠胰岛及移植后的小鼠和人胰岛中的血管。相反，BS-1可染色内源性和移植后的小鼠和人胰岛的毛细血管内皮（图4）。在检查的任何BS-1染色组织切片中，均未发现对应于未染色微血管的结构。在内源性人胰岛中，荆豆和BS-1染色的血管数量相似（分别为1139±97和1020±60条毛细血管/mm²；n=5）。BS-1染色切片的评估显示，内源性小鼠胰岛的血管密度高于内源性人胰岛，但小鼠和人移植物内分泌组织中的毛细血管数量相似，且均显著低于内源性胰岛（图5）。在移植物中包围小鼠和人胰岛的结缔组织间质中，发现的毛细血管数量明显多于移植物内分泌部分，因此移植物的平均血管密度更高（图5）。结缔组织间质约占小鼠和人胰岛移植物的30%。将人胰岛移植物的血管密度与供体年龄进行相关分析时，发现整个移植物的血管密度与供体年龄呈负相关（图6），但移植物的内分泌或间质部分则无此相关。

图4. 用BS-1凝集素染色的微血管内皮（红色）。A，内源性人胰腺胰岛（比例尺，20 µm）。B，移植到肾包膜下的人胰腺胰岛（比例尺，20 µm）。

图5. 内源性小鼠和人胰腺胰岛及移植到正常血糖裸鼠肾包膜下的小鼠和人胰岛的血管密度。数值分别给出内分泌组织本身（黑色柱）和整个胰岛移植物（斜线柱）。测量在移植后1个月进行。所有值均为6至8只动物的均值±标准误。，与内源性小鼠胰岛相比P<0.05；†，与相应内源性胰岛相比P<0.05。所有比较均采用ANOVA。

图6. 整个胰岛移植物血管密度与供体年龄的关系。人胰岛移植物血管密度的测量在移植到正常血糖裸鼠肾包膜下1个月后进行。分析采用简单线性回归（n=7；r=0.88；P<0.05）。


讨论


胰腺β细胞通常对代谢活性和氧消耗有很高的需求，以满足胰岛素分泌的不同需要。为满足这些需求，必须对胰岛组织进行充分的氧合。在以往的研究中，我们发现内源性大鼠胰岛的组织氧分压约为40 mm Hg，而移植后的大鼠胰岛则明显较低。在本研究中，在移植到裸鼠体内1个月后，小鼠和人胰岛的氧分压也显著降低。这些发现因此表明，移植胰岛的低组织氧分压不仅限于同基因移植的大鼠胰岛，在移植的人胰岛中也同样可见。


移植胰岛组织的低氧合提示血管再生重建不足。然而，移植胰岛通常被认为在7–14天内迅速完成血管再生重建。已有研究旨在定量测定啮齿动物胰岛移植物的血管，但直到最近才有研究比较移植胰岛与内源性胰岛的血管密度。在本研究中，与内源性胰岛相比，移植到肾包膜下的小鼠和人胰岛的毛细血管密度均较低。至少对于小鼠胰岛，如果将胰岛移植到脾脏内或门静脉内（肝脏），血管再生重建并未改善。对小鼠和人胰岛移植物血管性的研究显示，在移植物中包围单个胰岛的结缔组织中存在大量毛细血管。我们在移植到肝脏门静脉内或注射到脾脏内的小鼠胰岛中也发现了类似结果。移植物内毛细血管这种不均匀且看似不适当的分布原因尚不清楚。间质中高血管密度可能补偿了移植物内分泌部分低血管密度的不足。如果是这样，这也提示内分泌组织的血管再生重建存在某些缺陷。很难将本研究中移植胰岛血管密度的结果与以往测量啮齿动物移植物血管的研究进行比较，因为Menger等仅评估了植入皮褶腔的单个胰岛，而Merchant等未提及是否分别评估了内分泌和结缔组织部分。


我们此前已观察到，BS-1凝集素对内源性和移植后啮齿动物胰岛的微循环血管产生一致的染色。BS-1可染色多种物种的血管内皮，但很少染色人体组织。然而，本研究表明，该凝集素的染色适用于内源性和移植后的人胰岛。有趣的是，特异性针对人内皮的荆豆凝集素可染色内源性人胰岛，但不能染色移植后的人胰岛。这进一步支持了以下观点：培养后移植胰岛中新形成的毛细血管网络来源于受者。


激光多普勒血流细胞仪显示，胰岛移植物的血液灌注量仅约为肾皮质血流量的50%，即约为内源性胰岛血流量的50%。人胰岛移植物和小鼠胰岛移植物的血液灌注之间无差异。在大鼠中，我们使用激光多普勒技术也记录到类似的低血流量。在此应注意，激光多普勒血流细胞仪测量的是被照射组织内所有移动血细胞的整体血液灌注。本研究和最近一份报告揭示，移植物内大多数毛细血管为间质毛细血管，因此可能对整体移植物血液灌注有显著贡献。然而，由于氧弥散距离的限制，可以预期内分泌部分毛细血管中的血流主要贡献于向内分泌细胞输送氧气。这种后者的血流必然低于本研究中记录的整个移植物的血流量。事实上，在使用微球和超声血流探头联合进行的实验中，观察到营养性胰岛移植物血液灌注仅为内源性胰岛的约10%。在部分胰腺切除动物肾包膜下自体移植的胰岛中，记录到更接近内源性胰岛的血流量。然而，在这些后者的实验中，部分胰腺切除术的影响难以评估。


观察到人胰岛移植物的血液灌注随器官供体年龄的增加而降低。尽管鉴于观察数量有限（n=7）应持谨慎态度，但似乎存在非常强的相关性。有趣的是，供体年龄与这些移植物的总血管密度之间也获得了类似的负相关。这些综合发现表明，来自年轻供体的胰岛在诱导胰岛移植物血管形成方面具有更高的能力。其机制尚待确定，但可能涉及随年龄增长胰岛产生的血管生成因子（如血管内皮生长因子或碱性成纤维细胞生长因子）减少。未观察到供体年龄与移植后人胰岛氧分压之间的相关性。特定位置的组织氧分压取决于多个参数，即血液灌注向该部位供氧、氧的弥散能力、氧摄取（主要根据Bohr方程随血液pH变化）和细胞氧消耗。因此，组织氧分压与血液灌注之间很少见到简单的相关性。


尽管血管密度和组织氧分压降低，但移植胰岛仍保持功能活性，这通过胰岛素免疫组织化学得到证实。然而，移植后获得的胰岛功能是否最佳尚不确定。在临床胰岛移植中，即使采用成功的埃德蒙顿方案，仍需要 surprisingly 大量的胰岛（约900,000胰岛当量）才能获得胰岛素独立性。在胰岛素瘤细胞系βTC3细胞的实验表明，氧分压低于25 mm Hg会逐渐使这些细胞从有氧代谢转向更多无氧代谢，伴随乳酸产生增加。在氧分压低于7 mm Hg时，观察到βTC3细胞的胰岛素分泌减少。类似地，单个大鼠胰岛细胞聚集体（5–10个细胞）的葡萄糖刺激胰岛素分泌受低于12 mm Hg的影响。


总之，移植的人胰岛血管密度显著降低，伴随组织氧分压低下。显然有必要尝试改善胰岛血管再生重建，因为这可能显著减少获得胰岛素独立性所需的移植β细胞数量。


致谢


衷心感谢Astrid Nordin和Eva Törnelius的精湛技术协助。本研究使用了比利时布鲁塞尔β细胞移植中心制备的人胰岛。对照人胰腺样本由乌普萨拉大学医院病理学系Per Westermark教授慷慨提供。