移植胰岛的血流量测量


采用激光多普勒血流细胞仪（PF 4001-2，Perimed，瑞典斯德哥尔摩）配合针式探头（411 mm尖端；外径0.45 mm；Perimed）测量胰岛移植物和邻近肾皮质的血液灌注。使用显微操作器将血流探头垂直于固定的组织表面定位，并注意避免对组织造成任何压迫。在每个动物中，对移植胰岛和肾皮质至少进行三次血流量测量。计算每个动物这些测量的平均值，视为一次实验。由于难以用血流物理单位校准仪器，所有血流值均以任意组织灌注单位表示。由于内源性胰岛体积较小，无法通过激光多普勒法测定其血液灌注。


血液和尿液参数测量


从尾尖切口采集的样本，使用试剂试纸（Medisense，Baxter Travenol，美国伊利诺伊州迪尔菲尔德）测定血糖浓度。在血流量和氧分压测量结束时，采集血样分析红细胞压积和血气。pH低于7.30、pO2低于10 kPa、pCO2高于6.8 kPa或红细胞压积低于40的动物被排除在研究之外。


光学显微镜评估


在氧分压和血流量测量后，取出携带移植物的左肾或对照动物的胰腺，用10%（体积/体积）甲醛固定，并包埋于石蜡中。在胰腺切除术过程中获得外观正常的人胰腺样本，并以相同方式处理。这些胰腺供体的平均年龄为58±9岁（范围26–74岁）。制备胰岛移植物和胰腺的连续切片（5 µm厚），并按此前详细描述的方法用凝集素巴西木（Griffonia）simplicifolia（BS-1）或荆豆（Ulex europaeus）染色。切片用苏木精复染。阳性对照切片包括用于BS-1的石蜡包埋大鼠肺和用于荆豆的石蜡包埋人肺。只有BS-1在所有小鼠和人样本中均产生一致的血管染色，因此在后续方案中被选用。在每个动物中，随机选择胰腺或胰岛移植体所有部分BS-1染色的12个或更多组织切片进行评估。在立体显微镜下（放大倍数×600）对内源性和移植胰岛中染色的血管数量进行定量。在胰岛移植物中，结缔组织包围着移植物中的单个胰岛。因此，分别计数内分泌组织和结缔组织中的血管数量。通过直接点计数法确定内分泌和结缔组织的比例。为此，在光镜下以×600放大倍数计数与胰岛移植物中结缔组织间质和内分泌细胞重叠的交点数。在每个胰岛移植物中计数约12个视野（对应约1500个点）。使用计算机化形态测量系统（MOP-Videoplan，Carl Zeiss，瑞典斯德哥尔摩）确定所研究内源性和移植胰岛的面积。然后计算血管密度，即每测量胰岛或移植物面积（平方毫米）中发现的染色血管数量。


统计分析


所有值均以均值±标准误表示。使用ANOVA（StatView，Abacus Concepts, Inc.，美国加利福尼亚州伯克利）进行数据的多重比较，并使用Bonferroni方法校正P值。通过简单线性回归进行相关分析。关于两只接受同一供体胰岛的小鼠，计算这两只移植物的平均血管密度、pO2和血液灌注，因此在后续统计评估中仅代表一个观察值。对于所有比较，P<0.05被认为具有统计学意义。


结果


体重和血糖浓度


受试动物的平均体重为27.5±0.4克（n=22）。所有研究的小鼠血糖均正常，在进行氧分压和血流量测量时，血糖浓度为6.1±0.3 mmol/L（n=22）。各研究组之间的体重和血糖浓度无差异。


组织氧分压


内源性小鼠胰腺胰岛的组织氧分压约为40 mm Hg，而邻近外分泌胰腺的组织氧分压略低（约25 mm Hg）（图1）。与内源性小鼠胰岛相比，移植后的小鼠和人胰岛的组织氧分压均显著降低（图1）。移植物邻近的浅表肾实质的组织氧分压约为15 mm Hg（图1）。

图1. 内源性胰腺胰岛（黑色柱）及移植到正常血糖裸鼠肾包膜下的小鼠（白色柱）和人（斜线柱）胰岛的平均氧分压。同时给出了胰岛周围组织的氧分压值，即外分泌胰腺（黑色柱）和肾皮质（白色柱和斜线柱）。测量在移植后1个月进行。所有值均为6至8只动物的均值±标准误。，与内源性胰岛相比P<0.05。所有比较均采用ANOVA。


动脉血压和血流量测量


所有动物的平均动脉血压约为85 mm Hg。移植后的小鼠和人胰岛的血液灌注量均约为肾皮质血流量的50%（图2）。人胰岛来自年龄19–53岁的供体。发现供体年龄与移植胰岛的血液灌注之间呈强负相关（图3）。

图2. 移植到正常血糖裸鼠肾包膜下的小鼠（白色柱）和人（斜线柱）胰岛的血流量。同时给出了携带移植物的肾皮质血流量对应值。测量在移植后1个月进行。所有值均为6至8只动物的均值±标准误。

图3. 人胰岛移植物血流量与供体年龄的关系。人胰岛移植物血流量的测量在移植到正常血糖裸鼠肾包膜下1个月后进行。注意，拉长的点（箭头所示）代表两个几乎重叠的观察值。分析采用简单线性回归（n=7；r=0.91；P<0.05）。