3.3 葡萄第七组 ERF（VvERF-VII）的计算机模拟和体外特性


鉴于葡萄 HRE2 同源物表达升高和 DEG 启动子区域中 HRPE 基序的富集，我们寻求调查 VvERF-VII 同源物作为 O₂/NO 依赖性 N-末端规则蛋白水解底物的潜力。这将可能暗示它们是芽萌发期间观察到的发育性缺氧的调控因子。转录数据分析鉴定了先前鉴定的三个 VvERF-VII 编码序列中的微小基因型变异。本研究中的三个 VvERF-VII 转录本根据 Licausi 等人的命名法被指定为 VvERF058.1（VIT_05s0077g01860）、VvERF057.1（VIT_07s0005g00820）和 VvERF059.1（VIT_09s0002g00470）。在每个 VvERF-VII 的推导氨基酸序列中发现了 APETALA2/ERF 结构域和 N-去稳定子基序（图 5a）。虽然仅 VvERF057.1 在本研究呈现的数据中差异表达，但并非所有植物 ERF-VII 都受氧气水平转录调控。例如，在拟南芥中，只有 HRE1 和 HRE2 在缺氧下转录诱导。

图5. 葡萄ERF-VII基因的结构、层次聚类和体外翻译。(a) 葡萄中第七组ERF-VII三个成员的结构。这三个转录因子拥有APETALA2/ERF结构域和N-去稳定子基序。(b) 葡萄基因组中ERF-VII氨基酸序列与拟南芥（Arabidopsis thaliana-At）、水稻（Oryza sativa-Os）和大麦（Hordeum vulgare-Hv）的层次聚类树。使用Jukes-Cantor遗传距离模型以邻接法从蛋白质序列构建树，节点中显示引导重采样值。这些数据表明VvERF057.1和VvERF057，以及VvERF059.1和VvERF059相似，而VvERF058.1和VvERF058相同。这两个相同蛋白也被鉴定为该组的异常值，而VvERF059.1和VvERF059与AtRAP2.12和AtRAP2.2关系更密切。(a)和(b)中的序列分析在Geneious中进行。(c) VvERF-VII蛋白（MC-VvERF057.1、MC-ERF058.1和MC-VvERF059.1）在体外兔网织红细胞系统中的降解依赖于N-末端半胱氨酸（MC-），因为Cys2到丙氨酸的定点突变减弱了降解。此外，野生型MC-构建体在缺氧条件下稳定，证实了野生型VvERF-VII的氧气依赖性不稳定性。呈现的图像是至少三个独立重复的代表。数值0、30和60表示加入放线菌酮终止体外进一步蛋白质合成后的采样时间点（分钟）


本研究和 Licausi 等人的 ERF-VII 蛋白，以及拟南芥、水稻和玉米的 ERF-VII 蛋白的层次聚类分析（图 5b）表明，VvERF058.1 和 VvERF058 相同，与呈现的其他葡萄或其他物种的 ERF-VII 相似性最低。VvERF057.1 和 VvERF057 之间，以及 VvERF059.1 和 VvERF059 之间发现高度相似性，后者与 RAP2.2 和 RAP2.12 聚类。在推导的 VvERF057.1 和 VvERF059.1 氨基酸序列与先前报道的序列比较中鉴定了微小序列变异，反映了基因型之间的差异。


3.3.1 VvERF-VII 是体外氧气依赖性 N-末端规则蛋白水解的底物


N-末端半胱氨酸（Cys2）是 ERF-VII 中的三级去稳定残基，受 N-末端规则蛋白水解调控。然而，Cys2 的存在不足以预测 N-末端规则蛋白水解；例如，水稻 ERF-VII SUB1A 先前被证明逃避这种调控，尽管携带 Cys2。因此，我们使用体外翻译系统检查了 VvERF-VII 的稳定性，使用全长野生型（MC-）构建体和 Cys2 突变为丙氨酸（MA-）的构建体，后者减弱了 N-末端规则蛋白水解。此外，我们检查了常氧或缺氧条件下的稳定性。每个野生型 MC-VvERF-VII 在常氧条件下迅速降解，而突变的 MA-构建体是稳定的，MC-构建体在缺氧条件下也是稳定的（图 5c）。因此，VvERF-VII 是体外通过 N-末端半胱氨酸残基进行氧气依赖性 N-末端规则蛋白水解的底物，如同拟南芥中一样，这与呈现的转录组和生理数据一起，暗示 VvERF-VII 在协调芽萌发期间生长有效恢复方面具有重要的发育调控功能。


4 结论


与缺氧相关的适应和发育的主要焦点集中在保守的转录响应上，这些响应在植物中主要由一小族对氧气和一氧化氮不稳定的转录因子 ERF-VII 调控。这里呈现的数据为葡萄 ERF-VII 通过氧气依赖性信号传导在葡萄从静止到芽萌发的转变中发挥重要功能提供了强有力的证据。芽萌发期间组织氧含量和初级代谢的急剧转变伴随着缺氧的转录标志；然而，这与分生组织特性和细胞增殖基因的恢复相协调。约 20% 的葡萄基因组中拥有 HRPE 启动子基序的基因在芽萌发的前 24 小时差异调控。HRPE 基序是 ERF-VII 转录因子对几个保守缺氧响应基因进行转录调控所必需的。葡萄基因组中编码的三个 ERF-VII 蛋白中的每一个都是体外氧气依赖性 N-末端规则蛋白水解的底物，将这些转录因子鉴定为葡萄从静止到芽萌发转变期间生长和代谢功能有序转录调控的有力候选者。此外，缺氧诱导的转录先于氧化还原稳态相关转录本的大量积累，这与我们先前观察到的芽萌发期间超氧化物的空间转移一致。广泛的转录方法还使得鉴定出休眠后芽中有序且功能性生长恢复的新型候选调控因子，包括 GASA-、TCP-、MYB3R-、PLT- 和 WUS-样转录因子。这些中的每一个在其他植物系统中的分生组织和细胞周期调控功能已被证明，但除了包括 BRANCHED1 的 TCP 家族外，没有证据表明它们在芽生长或分枝中的功能。我们认为 TCP 和 GASA 蛋白特别有趣，因为每个家族的多个成员已被证明受氧化还原调控，并且这里鉴定的至少一个差异调控的 GASA 基因拥有 HRPE 启动子基序。


致谢


作者感谢 Colin Gordon 的葡萄栽培讨论和 Peter Nuich 慷慨提供生物材料，Tim Colmer 教授共同指导 KM 并提供生理测定建议，Oliver Berkowitz 博士进行初步 RNAseq 分析并帮助开发生物信息学流程，以及 Ole Pedersen 教授和 Dennis Konnerup 博士提供 pO₂ 分析的技术建议。作者感谢西澳大学显微镜、表征与分析中心澳大利亚显微镜与微分析研究设施的设施和科学技术援助，该设施由大学、州和联邦政府资助。代谢物分析在西澳大学代谢组学中心进行，该中心得到西澳大利亚州政府与澳大利亚联邦政府通过国家合作研究基础设施战略（NCRIS）的基础设施资助支持。本研究得到澳大利亚政府向 K.M. 颁发的澳大利亚奖学金以及澳大利亚研究委员会向 M.J.C.（LP0990355 和 LP130100347）和向 M.J.C.、C.H.F. 和 J.A.C.（DP150103211）的资助支持。P.A.R. 得到 LP130100347 支持，S.S. 得到 DP150103211 支持。这些资助还得到西澳大利亚州农业和食品部以及代表西澳大利亚葡萄酒行业的西澳大利亚葡萄改良协会的支持。K.M. 和 M.J.C. 感谢澳大利亚葡萄酒协会提供的旅行奖学金，该奖学金支持了部分研究和合作。M.J.C. 和 C.H.F. 感谢英国皇家学会提供的社会国际交流 502011/R2（IE111477）联合项目资助以支持这项工作。


作者贡献


K.M. 进行生物学实验，进行所有生理和生化分析，并为代谢物测定准备材料。P.A.R. 进行所有生物信息学分析并准备所有图表。S.S. 监督并协助生理、代谢和生化分析以及转录数据的解释。D.J.G. 提供载体、方案和指导体外研究。J.A.C. 提供实验条件建议，进行 pO₂ 数据的统计分析，并建议代谢物数据的统计分析。C.H.F. 参与研究构思和结果起草。M.J.C. 构思和设计实验并撰写手稿。所有作者批准了手稿的最终版本。