3 结果与讨论


3.1 生理学和代谢物分析


3.1.1 初级代谢和组织氧化的恢复在很大程度上独立于光照


温带木本多年生植物如葡萄通常从带有休眠混合芽的芽木插条进行商业繁殖，混合芽包含被多层苞片和鳞片包裹的胚芽。芽木通常在黑暗中于约 4°C 储存数周或数月以克服休眠并鼓励更均匀的生长恢复。我们使用单节外植体研究了这种芽的生长恢复，该外植体已被广泛用作研究葡萄早期枝条和花序发育生理学的模型系统。为了调查芽生长恢复过程中的生理变化，我们评估了从 4°C 移除后前 144 小时内芽的呼吸 CO₂ 产生和水分含量。为了在非或低胁迫条件下操纵生长，特别是初级代谢，我们对比了光照存在和缺失对芽萌发的影响。光照入射具有对分生组织活动至关重要的信号和底物功能，通过光受体介导的信号传导和光合氧气和蔗糖的产生，促成或增强许多重要的植物发育转变。


许多物种的芽生长需要光照入射。虽然葡萄芽显然不需要光照就能萌发，但光照入射确实对芽内的花序起始和结实性有强烈影响。在本研究中，我们主要关注光照作为促进光合氧气合成的底物的作用。光照入射对光合种子的初级代谢和组织氧张力有强烈影响，由于缺氧是本研究的重点，我们假设缺氧程度（低芽氧张力）会直接受光照影响。因此，外植体在持续黑暗（D）或暗/光周期（DL；12/12 小时）下生长。这两个时间点之间无论光照条件如何都没有可见的表型差异；所有实验芽都处于芽膨大阶段（EL2/3），在芽萌发（EL4）之前。水分含量和呼吸的增加遵循相似的模式，具有显著的发育效应但光照没有显著影响（p ≤ .05；图 1a）。叶绿素含量的变化没有统计学显著性，尽管处理（±光照）和时间之间似乎存在相互作用，使得净叶绿素含量仅在光照存在下维持。糖和淀粉含量的时间变化是显著的，但光照效应仅在时间与处理的相互作用中显著，且通常较小。葡萄糖和果糖浓度似乎在 72 小时达到峰值，随后下降，这也反映在淀粉含量的下降中（图 1a）。

图1. 葡萄（Vitis vinifera var. Crimson Seedless）在冷藏后于23°C条件下芽萌发期间碳水化合物代谢物和生理学特征的概述，在持续黑暗（D，粉色线）或12/12小时暗/光（DL，蓝色线）光周期制度下。(a) 在芽发育的3、24、72和144小时测量水分含量（H₂O）、呼吸速率（CO₂）以及叶绿素、葡萄糖、蔗糖和淀粉的浓度，以鲜重或干重（FW、DW，n = 3个重复，每个重复四个芽）报告。使用二阶多项式拟合时间-响应关系进行ANCOVA，并使用残差标准误差估计预测均值的95%置信限（误差条），其中模型具有统计学显著性（n = 3个重复，每个重复四个芽，原始数据叠加，空心圆）。(b) DL（蓝色）和D（粉色）条件下72和144小时的内部氧分压（pO₂）分布。数据代表原始数据的散点图（n = 3个单独芽），应用回归曲线并显示95%置信区间为灰色阴影。D条件的pO₂数据来自Meitha等人，根据CC BY许可。


组织氧含量（pO₂）提供了氧气代谢的空间分辨率。芽在芽萌发的最早阶段（3 小时）相对缺氧，随后在 24 小时内显著氧化。然而，在之前的报告中，芽仅在持续黑暗中生长。在这里，我们表明，与 D 条件相比，DL 条件下 72 小时 pO₂ 最低值或芽核心处 pO₂ 的差异可以忽略不计（图 1b）。


综合来看，这些数据表明芽萌发期间初级代谢的恢复是迅速的，在 72-144 小时内呼吸和淀粉水解增加。我们之前假设对比光照存在和缺失会显著影响氧气依赖性生理学和代谢。在我们测定的指标中，只有叶绿素含量似乎受到影响，但这并不显著，因此，我们得出结论，葡萄芽萌发期间代谢的恢复不受光照存在的影响。


3.2 转录组分析


我们进行了短读长 RNA 测序，以进一步调查芽萌发前 6 天内转录调控的动态，这先于叶片出现（0、3、24、72 和 144 小时）。归一化 TPM 数据的树状图和 PCA 表明，每个条件的重复聚在一起，第一和第二主成分按时间和处理区分条件，共同解释约 40% 的方差。每个时间点的转录组与每个处理的前一时间点进行对比，允许解释发育转变和光照的影响。差异表达基因（DEG）的数量（FDR ≤ 0.01）在前 3 和 24 小时（3/0 和 24/3 小时）显著大于后续阶段之间，尽管后期的时间间隔更大。光照存在与缺失相比，DEG 数量和幅度的唯一显著差异发生在最后阶段（144/72 小时），此时 DL 条件下差异调控的基因数量大于 D 条件，特别是在 ≥10 倍。对于进一步分析，我们将数据限制在 FC|2.5|，产生一个核心集，包含在至少一个比较中代表的 4022 个 DEG。针对葡萄参考基因组为核心集 DEG 分配功能注释。在总核心集中，14.9% 的 DEG（846）被匹配到"未知"分支类别功能。在剩余 3176 个 DEG 所代表的 12 个分支类别中，初级代谢（28.9%）、转运概述（12.6%）和信号传导（10.2%）占所有基因分配主要功能的 50% 以上。对于属于多个功能类别的转录本，每个都被考虑在内。


在持续黑暗条件下进行转录数据的进一步分析和功能富集。在前两个时间比较（3/0 和 24/3 小时）中，动态转录调控是明显的，包括细胞器和细胞生物发生、细胞分裂、代谢和转运。相比之下，仅在 72/24 小时比较中富集了初级代谢，在 144/72 小时没有类别富集（图 2a-d）。与光合系统相关基因的强烈调控支持了这样的结论：静止芽即使在无光照情况下也准备好发育自养代谢，温度而非光照是葡萄芽萌发的主要触发因素。