2 材料与方法


2.1 植物材料和生理测定


除非另有说明，本研究中使用的水为 Milli-Q® 水，化学品为分析级。葡萄（Vitis vinifera var. Crimson Seedless）带静止芽的枝条于仲冬从西澳大利亚的一个葡萄园（33.694°S, 115.102°E）采集，并在黑暗中于 4°C 储存直至需要（4 个月）。这段冷藏期与研究树莓休眠解除所用的时间相似，能够实验性地近似温带气候的冬季。实验前，将储存的枝条从 4°C 取出，将第 5-7 节的芽切成完整的单节插条（外植体），节点上方约 10 mm 茎段，下方约 40 mm 茎段。然后将外植体种植在湿润的蛭石中，在生长条件下维持恒定温度 23°C，在持续黑暗或暗/光处理（12/12 小时暗/光周期，150 μmol 量子·m⁻²·s⁻¹）下，用去离子水浇至田间持水量（即基质持水并排水），持续 3、24、72 或 144 小时。暗/光制度以 6 小时黑暗开始，随后交替进行 12 小时光照和黑暗循环，因此 24、72 和 144 小时的样品在光照期中间采集。这些时间点之间在发育上没有可见差异，无论光照条件如何。两个时间点均被归类为 EL2/3 的芽膨大阶段（改良的 Eichorn-Lorenz [EL] 量表），即在指示严格意义上芽萌发（EL4）的叶尖出现之前。在这些条件下，芽在 7-10 天内达到 50% 芽萌发（EL4），处理条件之间差异最小；然而，在光照存在下芽萌发加速的趋势是明显的（数据未显示）。对于代谢物和转录分析，采样后立即从茎上切下芽，直接浸入液氮中，并在 -80°C 下储存直至需要。


芽呼吸（三个生物学重复，每个重复四个芽）按照先前描述的方法进行。内部氧分压（pO₂；三个重复，每个重复一个芽）按照先前描述的方法测量，不去除外层鳞片。值得提及的是，pO₂ 数据中的噪声程度是由于芽的结构异质性。因此，我们展示了原始数据以及样条拟合和 95% 置信区间。在我们的实验中，144 小时的内部 pO₂ 分析不可靠，因此未展示。水分含量在与呼吸相同的芽上测量（三个重复，每个重复四个芽），方法如下：清洁切下的芽，不含琼脂，称鲜重（FW），然后浸入液氮中，在 -80°C 下储存或直接转移到冷冻干燥机中 >48 小时，然后记录干重（DW）。水合作用表示为每 100 g FW 的水质量（g）百分比。


2.2 糖、淀粉和叶绿素分析


用于代谢物分析的芽与用于呼吸和水合作用的芽相同（三个生物学重复，每个重复四个芽）。对于糖和淀粉，提取按照先前描述的方法进行，略有修改且规模较小。冷冻干燥的芽在自动冷冻研磨机中研磨，每个重复管中添加三个 2.8 mm 陶瓷珠。将含有 10 μM 核糖醇的提取溶液（MQW:甲醇:氯仿，5:5:3）加入 25 mg 芽粉中，剧烈涡旋，并立即浸入液氮中。核糖醇在制备提取溶液前溶解于 MQW 中，并在可溶性糖的气相色谱（GC）分析中作为内标。然后将样品在 4°C 下轻轻振荡 20 分钟以分散。在 60°C 下超声处理 10 分钟后，将试管在冰上冷却 2 分钟。在 4°C 下以 13,000× g 离心 3 分钟后获得两液相分离。极性上清液用于后续的可溶性糖测定过程，而沉淀用 100%（v/v）甲醇洗涤，在真空浓缩器中干燥，保留用于淀粉定量。


对于 GC，芽提取物通过与 20 mg/ml 盐酸甲氧胺在吡啶中于 65°C 混合 120 分钟进行衍生化。衍生物以分流模式（10:1）注入气相色谱仪，使用 30 μm 毛细管进样柱（VP5-MS，0.25 mm 直径和 0.25 μm 膜厚）。进样温度为 280°C，炉温程序为 325°C 保持 3.5 分钟，以 6°C/分钟升至 215°C 保持 1 分钟，以 40°C/分钟升至 320°C 保持 22 分钟。载气氦气以恒定流速 0.9 ml/min 流动。通过与真实标准和内标比较，鉴定和定量葡萄糖、蔗糖和果糖峰。


对于叶绿素分析，速冻芽在 1.5 ml 管中用微型研杵研磨成粉末。通过加入 0.2 N 盐酸（质量体积比为 10 mg FW/100 μl，室温）提取叶绿素为脱镁叶绿素。在 4°C 下以 14,000× g 离心 8 分钟后，分离上清液用于脱镁叶绿素定量。保留沉淀以测定干重。叶绿素表示为每 g DW 的微克脱镁叶绿素。


对于呼吸、水分含量、糖、淀粉和叶绿素的统计比较，使用二阶多项式拟合时间-响应关系进行 ANCOVA 分析。当处理因子具有统计学显著性时，使用残差标准误差估计预测均值的 95% 置信限。


2.3 RNA 提取、文库构建和测序


样品在液氮中研磨成细粉。使用 Spectrum Plant Total RNA 试剂盒进行总 RNA 提取，并按照制造商说明进行柱上 DNase 处理，随后进行异丙醇/乙酸盐沉淀。使用 NanoDrop 100 分光光度计和琼脂糖凝胶电泳测试分离 RNA 的质量和完整性。仅保留 A260/A280 比值 ≥1.95 的 RNA 用于分析。按照制造商说明使用 TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Plant 试剂盒制备 RNA 文库。测序在 Illumina HiSeq1500 仪器上以 100BP 单端运行进行。原始数据文件已存入 NCBI BioProject（PRJNA327467）。


2.4 转录数据处理分析


原始读长的摘要统计和读长映射信息在图 S2 中提供。使用 FastQC 评估原始读长的质量控制，并使用 Trimmomatic 进行接头污染和质量修剪。使用 BBMAP 去除 PCR 重复。


所得读长使用 Kallisto 比对到完整的 12X V1 葡萄 PN40024 参考基因组。使用 edgeR 和 limma Bioconductor 包进行基因表达谱分析。从 Kallisto 获得的计数矩阵在 edgeR 中读取，使用 Pearson 相关性（0.90-0.98）检查重复的质量。然后使用修剪均值 M 值（TMM）方法对原始数据进行归一化，并获得 log2 每百万转录本（logTPM）。然后应用线性模型（limma）。使用 Benjamini-Hochberg 方法对 P 值进行多重检验校正（FDR P ≤ 0.01）。然后使用倍数变化（FC|2.5|）过滤数据。


2.5 功能富集分析和主成分分析（PCA）


使用每个比较的三个差异表达基因列表（上调和下调基因以及两者）进行功能富集分析，使用 FatiGO 识别 Babelomics 5 中的显著功能类别，遵循葡萄特定的 12X V1 预测转录本功能分类，该分类改编自 MIPS FunCatDB 数据库，并根据 GO 数据库进行了修改。在 FatiGO 中进行 Fisher 精确检验，将每个研究列表与葡萄 12X V1 基因预测中的总非冗余转录本列表进行比较。在 Benjamini 和 Hochberg 多重检验校正后，P 值（P ≤ 0.01）被认为显著富集。最后，使用 R 的 prcomp() 函数构建 PCA 的协方差矩阵。使用 R 的 factoextra 库计算特征值和特征向量。


2.6 顺式调控基序分析和 BLAST


从调控序列分析工具（RSAT）检索前两个时间比较（3/0 小时和 24/3 小时）在持续黑暗中的差异表达基因（DEG）的葡萄启动子序列（编码序列上游 2.5 kb）；为防止与邻近基因重叠，选择了 noorf 选项。使用 Homer 进行顺式调控元件和 HRPE 的富集分析。使用拟南芥进化上保守的缺氧响应基因集来识别葡萄基因组 12X V1 中的同源序列。使用 CRIBI 的 BLAST 工具，选择所有 e 值 ≤35 的序列进行进一步分析。


2.7 质粒构建、体外蛋白翻译和免疫检测


按照先前描述的方法进行修改，进行体外测定以确定 VvERF-VII 蛋白作为 N-末端规则蛋白水解底物的能力。使用 Tetro cDNA 合成试剂盒按照制造商说明进行 cDNA 合成。使用特异性引物扩增葡萄的 ERF-VII 基因（VvERF-VII），在 5′端添加 EcoRI 限制位点，在 3′端添加 XbaI 限制位点，以帮助构建到 pTNT-3xHA 载体中。每个基因的编码序列与 3× 血凝素（HA）标签融合，用于 Western 印迹检测。根据制造商说明进行定点突变，改变 VvERF-VII 蛋白 N-去稳定子序列的倒数第二个密码子，将 N-末端半胱氨酸（Cys2）替换为丙氨酸，这减弱了 Cys/Arg-N-末端规则蛋白水解。通过克隆构建物的 Sanger 测序进行序列验证。本实验使用的所有独特引物列于表中。


翻译反应采用TNT-T7偶联网织红细胞裂解液系统（Promega公司，澳大利亚亚历山德里亚）在环境条件及无氧条件下，于定制的氧舱中进行。常氧条件为空气平衡状态（pO₂约为21 kPa，约21% v/v），而缺氧条件则通过用100% N₂气体冲洗来建立。使用微呼吸传感器（Unisense 优尼森公司，丹麦奥胡斯）在孵育开始和结束时测定pO₂值，验证pO₂在检测范围内保持不变。建立好氧条件后，将反应管置于氧舱内，密封整个氧舱，并将其浸入30°C的水浴中。


对于所有翻译实验，反应首先在30°C常氧条件下孵育30分钟，以生成初始量的蛋白质。随后加入0.1 mM环己酰亚胺以抑制蛋白质合成，并立即取T₀样本。接着，将反应管置于30°C下进行氧处理。在孵育30分钟和60分钟后，取子样本，并通过将反应管置于冰上并加入SDS缓冲液来终止反应。SDS-PAGE电泳按照Laemmli的方法，在4–20% Mini-protean® TGX ™预制蛋白凝胶（BioRad公司，澳大利亚格莱兹维尔）上进行。每个孔中加载12.5 μl体外反应产物及Laemmli样品缓冲液。通过预制凝胶电泳后对蛋白质进行化学发光检测，确认了等量上样；在转印至 PVDF 膜后，进一步验证了等量转印。蛋白质免疫印迹实验参照 Gibbs 等人的方法进行，但将一抗抗HA的稀释比例调整为1:20,000（Sigma，H9658，单克隆抗HA抗体，小鼠源），并使用ChemiDoc™ MP系统（BioRad）进行化学发光检测。实验条件通过来自拟南芥的阳性对照和阴性对照进行了验证，并使用了蛋白酶体抑制剂MG132（数据未显示）。



葡萄芽萌发过程中缺氧信号的发育调控机制——摘要、引言