摘要


木本多年生植物的休眠或静止芽通常结构致密，在葡萄（Vitis vinifera L.）中，其组织氧含量较低。恢复生长的决定时机难以精确预测，但一旦决定，组织氧含量的增加是迅速且受发育调控的。本研究表明，超过三分之一的葡萄中广泛保守的缺氧响应基因同源物，以及近五分之一的拥有植物缺氧响应启动子元件的葡萄基因，在芽萌发期间差异表达，这与分生组织特性恢复和细胞周期基因调控明显协调。随后，我们研究了葡萄 ERF-VII 同源物的分子和生化特性，这些同源物在其他物种中对氧气不稳定，并在缺氧响应基因的转录调控中发挥作用。3个 VvERF-VII 中的每一个都是体外氧气依赖性蛋白水解的底物，这是 N-末端半胱氨酸的功能。综合来看，这些数据支持氧气依赖性信号在决定葡萄芽萌发时机和有效协调方面具有重要的发育功能。此外，还鉴定出包括 GASA-、TCP-、MYB3R-、PLT- 和 WUS-样转录因子在内的新型调控因子，作为休眠后有序且功能性恢复生长的标志。


1 引言


从异养代谢向自养代谢的转变是高等植物营养器官发生的决定性特征。这一转变过程中的初始事件是迅速的，并伴随着细胞和细胞外环境的显著变化，特别是光和氧气依赖性线索，它们作为影响细胞功能和命运的强大信号发挥作用。木本多年生物种的芽萌发是这一转变的重要生态和农业背景。全球大部分水果和坚果供应来自多年生植物，依赖于芽萌发的成功时机和协调，因为它有助于同步开花、坐果和收获。多项研究模拟了芽萌发的生态需求，监测了特定化学胁迫或激素对休眠程度的影响，或进行了休眠起始和解除前期变化的详细分子分析。然而，很少有研究调查芽萌发过程中与转录变化相关的生理学。特别是，很少有研究调查组织氧含量的生理学，以及伴随的氧气依赖性代谢和信号传导。


组织氧含量已成为发育转变调节和胁迫适应的重要背景，既是有氧代谢的必需底物，也是翻译后修饰和信号传导的重要介质。葡萄是研究最深入的木本多年生植物之一。葡萄的成熟混合芽是一个复杂的器官，包含多个处于不同器官发生状态的分生组织。休眠期间代谢降至最低，随着芽萌发前的水合作用开始增加，然后在芽萌发开始时迅速加速。普遍认为，满足休眠（内休眠）的需冷要求先于代谢升高和芽萌发的开始。然而，芽萌发可由多种化学和物理胁迫诱导，事实上商业实践中通常利用其中一种或多种。氧化应激是这些胁迫响应中的共同主题，例如，叠氮化物抑制线粒体呼吸、过氧化氢处理、热休克或缺氧。热休克或氰胺（生产中常用）处理导致抗氧化、糖酵解和发酵酶、代谢和基因表达的类似诱导。缺氧和其他线粒体呼吸抑制剂也提高了过氧化氢水平，而缺氧或氰胺诱导了许多保守缺氧响应基因以及开花位点 T 同源物和 α-淀粉酶的表达。最近，氰胺被证明可增加葡萄芽中细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶多个同源物的表达，降低脱落酸水平，并在芽萌发前促进芽中一氧化氮的水平。虽然这些研究大多在胁迫条件下进行，但证据的权重和对产业的实用性表明，氧气依赖性代谢和信号传导在芽萌发的自然过程中具有重要作用。


植物中细胞缺氧的信号传导作用和机制最近被确立。尽管文献中主要关注胁迫诱导的缺氧，但调控性缺氧已成为一种重要的发育线索，对减数分裂、种子萌发和光形态发生至关重要，并且可能通过维持分生组织干细胞生态位的静止状态来保护基因组完整性。芽被木质化苞片包裹，结构类似于种皮。我们之前已经证明，葡萄静止芽（休眠后）的核心具有低组织氧含量（内部氧分压，pO₂ < 3 kPa ≈ 40 μM [O₂]）。在芽萌发的早期阶段，pO₂ 以受调控的空间方式增加，超氧化物的定位发生了空间和时间上的转移，从分生组织转移到原维管组织。虽然外层鳞片是氧气扩散的屏障，但 pO₂ 显然受初级代谢的调控，因为 pO₂ 最低值位于芽核心外围。然而，生理性缺氧不能仅由 pO₂ 的客观测量来定义。在生理性缺氧条件下，不同物种之间观察到许多保守的代谢和转录响应。这些包括氧化磷酸化的限制、淀粉和蔗糖分解的增加、底物水平磷酸化（糖酵解）和发酵的激活，以及 γ-氨基丁酸（GABA）支路的激活。


许多对缺氧的保守响应是转录调控的，特别是由第七组乙烯响应因子（ERF-VII）调控。氧气敏感的 ERF-VII 在氧气和一氧化氮存在下被靶向进行蛋白水解，这是其 N-末端基序（N-去稳定子）的功能，这一过程称为 N-末端规则蛋白水解。ERF-VII 中 N-去稳定子的共有基序 MCGGAI/L 对 O₂/NO 依赖性蛋白水解至关重要。降解过程由甲硫氨酸氨基肽酶（MetAP）从 N-末端切割甲硫氨酸启动，暴露半胱氨酸以供植物半胱氨酸氧化酶 1 或 2（PCO1/2）氧化，这一步骤需要氧气和一氧化氮。氧化的半胱氨酸随后被精氨酰 tRNA 转移酶（ATE）精氨酰化，触发与 E3 连接酶（N-识别蛋白）的相互作用，进行泛素化和蛋白酶体降解。在低氧和一氧化氮条件下，ERF-VII 被稳定并发挥转录调控作用。例如，拟南芥五个 ERF-VII 之一的相关于 APETALA2.12（RAP2.12）的稳定促进了几种缺氧响应基因的转录。RAP2.12 转录因子直接结合缺氧响应基因启动子区域中的特定基序，该基序由 12 bp 的顺式调控序列（5′-AAACCA[G/C][G/C][G/C]GC-3′）组成，称为缺氧响应启动子元件（HRPE）。该基序在拟南芥 49 个核心缺氧响应基因中的 39 个的启动子区域中出现 1-3 次，足以激活拟南芥中的 AtPCO1、侧生器官边界蛋白 41（AtLBD41）、RAP2.2 和 RAP2.12。然而，并非所有植物 ERF-VII 都是 N-末端规则蛋白水解的底物，因为下游赖氨酸的位置和暴露 N-末端的三级结构也决定了其通过 N-末端规则发挥作用的能力。


本研究的目的是调查氧气依赖性信号在协调葡萄芽萌发期间转录和代谢有效恢复中的作用。我们证明，在休眠后芽恢复生长的前 24 小时内，生理性缺氧状态的迅速发展反映在基因组范围的转录调控中。这体现在大量保守缺氧响应基因同源物的富集，以及拥有 HRPE 的基因在前 24 小时内的富集，在此期间组织氧含量仍然较低，而呼吸、糖消耗和淀粉水解增加。此外，我们证明葡萄 ERF-VII 转录因子是体外氧气依赖性 N-末端规则蛋白水解的底物，为缺氧信号在葡萄芽萌发期间的发育作用提供了强有力的证据。此外，转录和生理模式与自养生长和代谢能力的有序恢复相协调，即使没有光照也是如此。本研究为理解多年生植物芽萌发的发育调控提供了新的基准。此外，这些数据暗示了葡萄芽萌发对光照的兼性需求，我们在配套手稿中对此进行了探讨。