3 方法


3.1 微剖面


使用50微米宽的玻璃微传感器（OX-50和PH-50，Unisense A/S）在Vicuna溪流垫层中测量了O2和pH的微剖面。两个微传感器固定在双头微操作器（MM-33-2，Unisense A/S）上，间隔三厘米，安装在原位野外支架上，用于同时测量垫层内的O2和pH。因此，虽然数据和图中呈现的耦合O2和pH剖面并非来自同一垫层坐标，但剖面是在同一时间、相距三厘米的位置测量的，来自具有相似视觉和物理特性的垫层表面。


原位支架固定在Vicuna溪流东岸，同时通过手动调节微操作器以1毫米间隔将两个微传感器降入垫层。对于具有脆性二氧化硅结壳的垫层表面，在微剖面测量前立即用金属针刺穿结壳，以防止微传感器断裂。穿刺仅限于垫层表面的上部1-2毫米，以防止表层水和深层水的混合。


使用SensorTrace Suite程序（Unisense A/S）在每个深度记录O2和pH测量值，平衡时间约3秒。SensorTrace还用于现场测量前校准O2和pH计。O2微传感器使用曝气水（大气O2）和约2克抗坏血酸钠溶于100毫升0.1M NaOH（0% O2）进行校准。pH微传感器使用pH 4、7和10的缓冲液进行校准。微传感器数据使用以下方程从mV转换为毫摩尔氧浓度，其中[a] = 现场条件水温和气压下O2的溶解浓度（mM），S = 从微生物群落测量的信号（mV），S0 = 在0% O2溶液中校准的信号，Ssat = 在曝气溪水中校准的信号：


[O2] = [a] * ((S - S0) / (Ssat - S0))


由于安全考虑，未在Vicuna溪流使用光暗技术测量垫层内的光合速率。使用Matlab软件包中的griddata和contourf函数，通过三次曲面插值将多个微电极剖面可视化为二维横断面。


3.2 环境记录器和温度剖面


从4月26日至4月28日，使用安装在硅化垫层旁边地面上方37厘米处的便携式气象仪（Kestrel 5500，Kestrel Instruments）在Vicuna溪流收集天气数据。数据点以1分钟间隔收集，包括风速、气温和湿度。在同一时间段内，使用数据记录器（HOBO MX2202和MX2203，Onset Computer Co.）记录表层垫层（距水池北岸1.3米下游）的水温和环境光照水平。水温记录器传感器完全浸没在水中。所有记录参数的完整数据集可在表S1中获得。当溪流水温最高时（15:00），还使用Traceable温度计（范围：负50至300°C，精度正负1°C）作为溪流剖面收集了水温数据。


使用GoPro相机记录了Vicuna溪流垫层六小时（10:00至16:00）的视觉延时摄影。


3.3 SiO2浓度


从Vicuna溪流的四个位置（表1）收集了水样（n=4），一个位于源头池内，另外三个在下游更远处（距水池北缘0.7、1.3、4.0和6.0米）的垫层附近。样品收集在配有0.2微米过滤器的注射器中，以尽量减少来自硅藻等外部二氧化硅源的污染。二氧化硅浓度在巴黎地球物理研究所（IPGP，法国巴黎）使用HACH DR9000多参数便携式比色计测定。为了考虑运输过程中样品温度和pH的潜在变化，分析前将水样加热至适当温度一小时。水样的实验室pH值与Vicuna溪流中记录的现场值匹配（pH=6.8）。二氧化硅比色法的详细方法公开可在HACH硅钼酸盐HR方案8185中获得。报告的SiO2浓度误差范围为正负5%，基于50、100和150 ppm SiO2标准品的测量。使用免费地球化学软件包vMINTEQ计算了各种温度和pH值下溶液中非晶态二氧化硅的溶解度。


3.4 扫描电子显微镜


从Vicuna溪流和中盆地泉采集了垫层样品用于扫描电子显微镜（SEM）。不幸的是，Vicuna溪流的样品在返回实验室后被霉菌污染，而中盆地样品保存良好。因此，SEM图像不代表与Vicuna溪流微剖面和环境数据相同的地点。然而，两个地点的生物群落、上覆二氧化硅结壳和周围物理环境的物理和视觉特性支持相似的硅化模式。


对中盆地泉五个垫层样品的平面进行了SEM，样品被断裂成3至5毫米的碎片。样品在现场用2.5%戊二醛制备，并在分析前于4°C储存。成像前，样品用去离子水冲洗并风干，然后直接放置在带有碳胶的铝台上并溅射镀金。SEM图像在巴黎地球物理研究所PARI分析平台使用Zeiss EVO MA-10获得，15 kV和12毫米工作距离，SE模式。


使用同一台Zeiss SEM进行能量色散X射线光谱分析，以检查微生物垫层上结壳的元素组成。


3.5 DNA采样和分析


使用无菌技术从Vicuna溪流和中盆地泉批量收集微生物垫层样品。在Vicuna溪流，样品采集于三个O2和pH微剖面位置附近，距地热喷口与地热径流溪流的汇合处约1.3米下游，沿垂直于溪流岸和流向的横断面从溪流岸延伸到活跃生长垫层的前缘。样品对应于不同的垫层颜色、硅化风格和垫层纹理：（1）橙色簇状垫层（VS-1），（2）橄榄色未结壳垫层（VS-2A，2B），（3）橄榄色二氧化硅结壳垫层（VS-3）和（4）深绿色垫层边缘（VS-4），以研究微生物群落的组成和结构与原位地球化学和物理参数的关系。在中盆地泉，从两个位置采集了样品：（1）垫层中心的橄榄色二氧化硅结壳表面（MBS-2），和（2）垫层边缘较温暖的橄榄色二氧化硅结壳表面（MBS-4）。在两个地点，样品立即放入无菌袋中，并在0至4°C的隔热袋中储存直至到达实验室。采样后一周内，样品在负20°C冷冻以保存DNA。


使用Qiagen DNeasy PowerLyzer PowerSoil试剂盒（Qiagen Sciences，美国马里兰州日耳曼敦）按照制造商方案提取基因组DNA。对16S rRNA基因的V4-5区域（515f-926r）进行测序，深度约为每样品10万条读数，使用Illumina MiSeq（Illumina Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥）平台（MrDNA Labs，美国德克萨斯州Shallowater），使用细菌标签编码FLX扩增子（bTEFAP）测序技术。经过标准质量控制去除步骤后，过滤的、质量合格且去除嵌合体的16S扩增子文库平均每样品含7万条读数，使用最新的Greengenes（v.13.8）比对数据库与培养的数据库登录环境克隆进行比对。


在97%和99%的截断水平分别进行属和种水平的分类学分配。结果的质量合格且去除嵌合体的16S扩增子文库平均每样品含7万条读数。对丰富度大于0.1%相对丰度的生物体进行了研究，并按主要类别分为（1）代谢生长生理学和（2）耐氧性，以评估群落功能与每个样品中鉴定分类操作单元（OTU）的分类结构（%相对丰度）的变化。功能分配基于属水平OTU分配的培养代表物的生理学研究。

（图3 Vicuna溪流的环境记录。a 光照强度（lux，黄色）与气温和水温（°C，蓝色和黑色）。b 相对湿度（%，紫色）和风速（m/s，灰色））