研究简介:针对三维胃肠道类器官腔体微环境难以原位解析的技术瓶颈，尤其是胃组织存在人体最陡峭的质子梯度（腔体pH 1~3、上皮侧近中性）而传统pH敏感染料、荧光纳米传感器等方法存在校准复杂、易光漂白、有成像偏差等局限，Lyon等团队开发了基于显微操纵器控制的pH微电极高分辨率检测技术：选用尖端直径25μm的商用斜口玻璃pH微电极配合独立Ag-AgCl参比电极构建检测系统，经pH 4.01和9.21标准缓冲液两点校准后，可在立体显微镜视野下通过显微操纵器将微电极精准刺入悬浮于Matrigel中、直径>200μm的人原代胃类器官腔体，参比电极浸没于外周培养基中实现定点实时监测。该方法表现优异：同培养孔内类器官腔内pH均一，可达7.7±0.037，单点测量可持续至少15分钟；在大尺寸（>1000μm）类器官中还可捕捉到上皮表面到深部腔体约0.6的pH梯度，证实了其空间分辨能力；跨6次独立实验统计显示类器官平均腔内pH为7.13±0.09，且呈"培养液pH>Matrigel胞外基质pH>类器官腔体pH"的分布规律，说明腔内pH由上皮细胞主动生理活动调控而非被动受环境影响，研究同时用甲基红显色染料注射验证了微电极结果的可靠性。该技术突破了类器官腔体原位检测的长期限制，无需荧光标记即可实现高时空分辨率的pH动态监测，且平台通用性强，更换专用电极即可拓展至氧、一氧化氮、硫化氢、氧化还原电位等多参数分析，为优化类器官培养体系、提升模型仿生度，以及开展胃肠生理研究、药物筛选和疾病建模提供了关键的技术支撑。


Unisense微电极系统的应用


本研究中，Unisense微电极系统作为核心检测设备，承担了三维人胃类器官腔内pH高分辨率剖面的关键任务。研究人员采用Unisense生产的尖端直径25μm的斜面玻璃pH微电极（pH-25型）。实验时，将传代人胃类器官（直径200~1000μm）包埋于Matrigel并接种在玻璃底培养皿中，置于体视显微镜载物台；25μm pH微电极固定在Unisense显微操纵器上，参比电极则夹持于显微镜左侧支架并浸没在培养皿周围培养基中。微电极先后经pH 4.01和9.21标准缓冲液两点校准、确认响应斜率在50~70 mV/pH单位后方可使用。测量过程中，研究者在立体显微镜直视下手动操控显微操纵器，使微电极依次穿过培养基、Matrigel胞外基质，最终以一次性快速推进方式刺入目标类器官腔体，在每个区域停留约10秒待信号稳定后记录pH值，每个类器官腔内重复测3次取平均，每个实验条件至少分析10个不同类器官。借助可选的电动显微操纵器，还可沿垂直轴以100μm步长对>1000μm的大类器官进行从上皮表面到深部腔体的连续剖面扫描。依靠Unisense微电极系统微米级的尖端尺寸与显微操纵器的精准定位能力，研究者成功获取了同培养孔内类器官腔内pH约7.7±0.037、六次独立实验均值7.13±0.09的数据，揭示了"培养基pH > Matrigel基质pH > 类器官腔内pH"的三层梯度分布，并在大类器官中捕获到上皮表面至深部腔体Δ0.6的pH梯度，单次植入测量可持续至少15分钟。该设备使研究突破了传统pH敏感染料空间分辨率低、需复杂校准的局限，首次实现了对三维类器官腔体微环境的直接、实时、高空间分辨率pH剖析，且微电极测得的近中性pH与甲基红显色验证结果相互印证，为类器官腔体生理相关研究提供了可靠的技术平台，该系统的通用性还意味着通过更换探头即可拓展至O₂、H₂S、NO等多种理化参数的同步检测。


实验结论


本研究通过系统实验验证了基于Unisense微电极的三维人胃类器官腔内pH检测方法的可靠性与实用性，证实该手动/电动显微操纵微电极剖面技术可对直径>200μm的类器官实现高时空分辨率、非破坏性的原位pH监测：同培养孔内类器官腔内pH均一，基线约为7.7±0.037，单次植入测量可稳定持续至少15分钟；在直径>1000μm的大尺寸类器官中首次观测到上皮表面至深部腔体约0.6的pH梯度，证明该方法具备解析腔体内微尺度生理梯度的能力。跨6次独立实验统计显示，多次传代的成人干细胞来源胃类器官平均腔内pH为7.13±0.09，且呈现"培养液pH>Matrigel胞外基质pH>类器官腔体pH"的特征，说明腔内pH由上皮细胞主动离子转运活动调控，而非被动由培养环境决定；不同供体来源的类器官株系pH稳定在7.3~8.2区间，与传代次数无显著关联，符合该模型因多次传代丢失酸分泌壁细胞、以碳酸氢盐分泌为主的功能特征，微电极测得的近中性pH也与甲基红显色验证结果完全吻合。此外，该微电极平台具备良好通用性，通过更换专用探头可拓展至O₂、NO、H₂S、氧化还原电位等多参数检测，为类器官腔体微环境的功能表征、培养体系优化及胃肠生理、药理研究提供了关键技术支撑。

图1、A微电极表型分析设置示意图。(B) 用于表型分析的类器官培养物、周围基质外基质（ECM）及周围培养基的代表性图像（比例尺=5 mm）。(C) 类器官探针准备时正确放置微电极的示例（比例尺=500 μm）。缩写：ECM = 细胞外基质。

图2、在人类胃类器官中验证微电极探针的性能。（A）使用25 μm（pH-25）和50 μm（pH-50）微电极探针对胃腔中部pH值进行比较。数据来自10个独立类器官，每个类器官均来自同一代表性实验。（B）对10个独立类器官进行了三次重复的pH测量。采用单因素方差分析并进行多重比较。 （C）使用pH-25电极测得的pH值，在不同传代数下对五条类器官系进行分析，每条类器官系内测定了4至10个类器官，依据大小和可用性确定。。 （D）胃类器官及其周围Matrigel和培养基中的pH测量结果（n = 6个独立实验）。通过pH-25电极穿透胃上皮类器官获取数据。每个数据点为单个类器官内10次独立pH测量的平均值。采用单因素方差分析（p < 0.0001）。 （E）使用电动微操纵器对两个代表性类器官的上皮-腔内pH分布。（F）一个代表性类器官在时间上的pH稳定性（约19.8分钟）。将甲基红pH指示剂染料和盐酸微注射入胃类。

图3、经pH微传感器探针穿刺后结构变形的人类胃上皮类器官。比例尺 = 1毫米


结论与展望


本研究针对三维胃肠道类器官腔内微环境分析这一技术瓶颈，建立了一种基于显微操纵器控制pH微电极的高分辨率腔内pH检测新方法。胃内存在全身最陡峭的质子梯度（腔体pH约1–3，上皮附近近中性），而传统类器官pH分析主要依赖pH敏感染料或荧光纳米传感器，前者校准复杂、检测范围受限，后者易受光漂白、光毒性和成像偏差影响，且均难以直接、实时地获取类器官腔体内的真实pH值。选用商用斜口玻璃pH微电极（尖端直径25μm），配合独立的Ag-AgCl参比电极和高阻抗毫伏计，在立体显微镜视野下由显微操纵器将微电极精确推进至悬浮于Matrigel中的人胃类器官（直径>200μm）腔体内，参比电极则浸没于培养板周围培养基中，从而实现单细胞器层面的定点、实时pH记录。本研究依托Unisense微电极系统实现了三维胃类器官腔内pH的高分辨率原位检测。研究者选用Unisense 25μm斜面玻璃pH微电极（pH-25型）配合独立Ag-AgCl参比电极，经pH 4.01/9.21两点校准后，通过显微操纵器将微电极精准刺入包埋于Matrigel中、直径>200μm的人胃类器官腔体，参比电极浸没于外周培养基中完成电位测量。该系统凭借微米级尖端尺寸与精准定位能力，成功测得同培养孔内类器官腔内pH约7.7±0.037，跨实验均值7.13±0.09，揭示了"培养基>Matrigel>类器官腔体"的三层pH分布规律，并在>1000μm大类器官中捕捉到上皮至深部腔体Δ0.6的pH梯度，单次测量可持续15分钟以上。微电极数据经甲基红显色验证可靠，突破了传统pH染料空间分辨率低、需复杂校准的局限，为类器官腔体微环境研究提供了直接、实时的分析手段，且该平台可通过更换探头拓展至O₂、H₂S、NO等多参数检测。