结果


CSE和CBS在胎膜中的定位


CSE和CBS均在人类胎膜中表达（图1）。羊膜上皮和绒毛膜滋养细胞均被CBS和CSE抗体阳性染色。当抗体用过量CBS或CSE肽预吸收时，免疫反应性消失。此外，在血管内皮细胞和蜕膜中也发现CSE和CBS的阳性免疫染色。

图1胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）和胱硫醚-β-合酶（CBS）在人类胎膜中的定位。A和B：免疫组织化学分析显示CSE（A）和CBS（B）阳性染色的代表性切片。C和D：使用过量相应肽预吸收一抗获得的阴性对照切片。箭头指示阳性染色。原始放大倍数，×200（A-D）。AE，羊膜上皮；CT，绒毛膜滋养细胞；DC，蜕膜。


绒毛膜组织中CSE和CBS的表达以及硫化氢产生速率在足月分娩和早产分娩期间降低


蛋白质印迹分析显示，与TNL组相比，TL组中CSE和CBS的表达水平降低（图2，A和B）。与TNL组相比，PTL组中CSE和CBS的表达水平也较低。

图2 胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）和胱硫醚-β-合酶（CBS）表达、硫化氢产生速率，以及足月分娩（TL）、足月未分娩（TNL）和早产分娩（PTL）绒毛膜组织中15-羟前列腺素脱氢酶（PGDH）与CSE或CBS之间的相关性。从单胎妊娠妇女中收集TNL（n=24）、TL（n=24）或PTL（n=21）的绒毛膜组织。A-C：TNL、TL和PTL绒毛膜组织中CSE（A）、CBS（B）和PGDH（C）的蛋白表达。代表性蛋白条带显示在相应柱状图上方。D：绒毛膜组织匀浆中硫化氢产生的代表性迹线。E：TNL、TL和PTL绒毛膜组织中硫化氢产生速率。F和G：绒毛膜组织中PGDH与CSE或CBS之间的相关性。数据以平均值±SEM表示（A-C和E）。**P <0.01 与TNL相比。AOAA，氨基氧乙酸半盐酸盐；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；PAG，DL-炔丙基甘氨酸；PLP，吡哆醛-5'-磷酸盐。


绒毛膜组织匀浆在加入L-半胱氨酸后能够产生硫化氢。该效应被CSE抑制剂DL-炔丙基甘氨酸或CBS抑制剂氨基氧乙酸半盐酸盐阻断（图2D）。TL和PTL组中的硫化氢产生速率低于TNL组（图2E）。


如预期，PGDH水平在TL和PTL组中下调（图2C）。相关分析显示，CBS而非CSE水平与绒毛膜组织中PGDH表达相关（图2，F和G）。


硫化氢上调培养绒毛膜滋养细胞中PGDH表达和活性


然后检查了硫化氢是否影响绒毛膜滋养细胞中PGDH表达和活性。用 increasing 浓度的硫化氢供体NaHS（10⁻⁶至10⁻⁵ mol/L）处理培养绒毛膜滋养细胞24小时，导致PGDH mRNA和蛋白表达剂量依赖性地增加（图3，A和B）。NaHS的最高效应发生在5×10⁻⁵ mol/L。NaHS处理剂量依赖性地增加PGDH活性。最高效应由5×10⁻⁵ mol/L的剂量达到。硫化氢前体L-半胱氨酸（10⁻⁴至10⁻³ mol/L）也以剂量依赖性方式增加PGDH表达和活性。L-半胱氨酸（10⁻³ mol/L）的效应可被CBS抑制剂氨基氧乙酸半盐酸盐（10⁻³ mol/L）阻断，但不被CSE抑制剂DL-炔丙基甘氨酸（10⁻³ mol/L）阻断。

图3硫化氢对培养绒毛膜滋养细胞中15-羟前列腺素脱氢酶（PGDH）表达和活性的影响。A-C：NaHS对PGDH mRNA（A）和蛋白（B）表达以及活性（C）的影响。细胞用 increasing 浓度的NaHS（10⁻⁵至10⁻⁴ mol/L）处理24小时。D-F：L-半胱氨酸对绒毛膜细胞中PGDH mRNA（D）和蛋白（E）表达以及活性（F）的影响。细胞用 increasing 浓度的L-半胱氨酸（10⁻⁴至10⁻³ mol/L）处理24小时。G-I：DL-炔丙基甘氨酸（PAG）和氨基氧乙酸半盐酸盐（AOAA）对L-半胱氨酸刺激PGDH mRNA（G）和蛋白（H）表达以及活性（I）的影响。细胞在存在或不存在PAG和AOAA的情况下用L-半胱氨酸（10⁻³ mol/L）处理24小时。J-L：胱硫醚-β-合酶（CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）在L-半胱氨酸刺激PGDH表达中的作用。细胞转染CSE siRNA、CBS siRNA或乱序siRNA，然后用10⁻³ mol/L L-半胱氨酸处理24小时。CSE siRNA（J）和CBS siRNA（K）转染细胞中CBS和CSE的代表性表达。L-半胱氨酸对CSE siRNA和CBS siRNA转染细胞中PGDH表达的影响（L）。PGDH mRNA和蛋白表达及活性分别通过实时RT-PCR、蛋白质印迹分析和转化测定确定。代表性蛋白条带显示在相应柱状图上方。数据以平均值±SEM百分比对照表示（A-I和L）。n = 5个培养，每个进行三重复（A-I和L）。*P <0.05，**P <0.01 与溶媒对照相比；††P <0.01 与L-半胱氨酸相比。L-cys，L-半胱氨酸；PGFM，前列腺素F₂。


为进一步确认哪种产硫化氢酶负责硫化氢的作用，应用了靶向CSE和CBS的siRNA方法。将CBS和CSE siRNA转染到细胞中分别导致CBS和CSE降低83%和88%（图3，J和K）。L-半胱氨酸（10⁻³ mol/L）处理不影响CBS siRNA转染细胞中的PGDH表达。然而，L-半胱氨酸（10⁻³ mol/L）对PGDH表达的效应在CSE siRNA转染的细胞中仍然存在（图3L）。


miR-26b和miR-199a调节硫化氢对绒毛膜滋养细胞中PGDH表达的调节


miRNAs调节基因表达的转录后调节。最近，Montenegro等人已显示几种miRNAs在胎膜分娩开始时受到调节，并暗示miRNAs在妊娠和分娩中发挥作用。此外，我们先前的研究表明硫化氢可以调节胎盘滋养细胞中miRNAs的表达。我们探索了硫化氢是否通过调节靶向PGDH基因的miRNAs来调节PGDH表达。


生物信息学分析显示，靶向PGDH基因的miRNAs包括miR-199a、miR-26a和miR-26b。首先，使用PGDH-3'-UTR-荧光素酶报告基因检测检查PGDH是否是miR-199a、miR-26a和miR-26b的直接靶标。miR-199a和miR-26b模拟物均抑制PGDH-3'-UTR报告基因活性，而它们不影响突变PGDH-3'-UTR报告基因活性（图4，A和B）。相反，miR-26a模拟物对PGDH-3'-UTR报告基因活性没有影响。


此外，我们还检查了miR-199a和miR-26b模拟物或抑制剂对PGDH蛋白表达的影响。miR-199a和miR-26b模拟物均降低PGDH蛋白表达，而miR-199a和miR-26b抑制剂增加PGDH表达（图4C）。


然后探索了miR-199a和miR-26b在硫化氢调节PGDH表达中的作用。NaHS和L-半胱氨酸抑制绒毛膜滋养细胞中miR-199a和miR-26b的表达（图4，D至G）。miR-199a和miR-26b的模拟物逆转了NaHS和L-半胱氨酸对PGDH的上调。


miR-26b和miR-199a表达在足月分娩和早产分娩期间绒毛膜中上调


与TNL组相比，TL和PTL绒毛膜中miR-26b和miR-199a的表达水平显著增加（P<0.01）（图4，H和I）。CBS水平与miR-26b或miR-199a没有显著相关。PGDH与miR-26b或miR-199a之间也未发现显著相关性（数据未显示）。

图4 miR-26b和miR-199a参与硫化氢对15-羟前列腺素脱氢酶（PGDH）表达的调节以及绒毛膜中miR-26b和miR-199a的表达。A和B：含有PGDH 3'-非翻译区（UTR）及其3'-UTR中突变核苷酸的报告基因的荧光素酶检测。绒毛膜滋养细胞在不存在或存在miR-26a、miR-26b和miR-199b模拟物的情况下转染上述报告基因。使用双荧光素酶报告基因检测系统测量细胞裂解物中的荧光素酶活性。C：miR-26b和miR-199a抑制剂和模拟物对PGDH表达的影响。绒毛膜滋养细胞用miR-26b和miR-199a抑制剂和模拟物处理24小时。D和E：硫化氢对miR-199a和miR-26b表达的影响。细胞用L-半胱氨酸和NaHS处理24小时。通过实时RT-PCR测定miR-199a（D）和miR-26（E）的水平。F和G：miR-26b和miR-199a模拟物对硫化氢调节PGDH表达的影响。细胞在不存在或存在miR-26b（F）和miR-199a（G）模拟物的情况下用L-半胱氨酸和NaHS处理24小时。通过蛋白质印迹分析确定PGDH蛋白表达。H和I：足月未分娩（TNL）、足月分娩（TL）和早产分娩（PTL）组绒毛膜中miR-26b和miR-199a的水平。通过实时RT-PCR测定miR-26b（H）和miR-199a（I）的表达。数据以平均值±SEM百分比对照表示（F和G）；平均值±SEM（H和I）。n = 5个培养，每个进行三重复（F和G）。*P <0.05，**P <0.01 与溶媒对照相比；††P <0.01 与TNL相比。