摘要


绒毛膜中NAD依赖性15-羟前列腺素脱氢酶（PGDH）在控制子宫内前列腺素含量方面起着关键作用，并已被牵涉到分娩过程中。先前研究在胎膜中鉴定了产硫化氢酶胱硫醚-β-合酶（CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）。我们研究了硫化氢是否参与分娩期间绒毛膜中PGDH表达的调节。从早产分娩和足月分娩或未足月分娩的孕妇中获取绒毛膜组织。与未足月分娩组相比，足月分娩和早产分娩组中CSE和CBS水平以及硫化氢产生速率均下调。CBS水平与绒毛膜中PGDH表达相关。硫化氢供体NaHS和前体L-半胱氨酸剂量依赖性地刺激培养绒毛膜滋养细胞中PGDH表达和活性。L-半胱氨酸的作用被CBS抑制剂和CBS siRNA阻断，但未被CSE抑制剂和CSE siRNA阻断。硫化氢处理抑制了绒毛膜滋养细胞中miR-26b和miR-199a的表达。miR-26b和miR-199a模拟物阻断了硫化氢对PGDH表达的上调。我们的结果表明，硫化氢在人类妊娠期间维持绒毛膜中PGDH表达方面起着关键作用。产硫化氢酶表达的降低导致分娩期间子宫内前列腺素含量增加。


引言


前列腺素（PGs）在分娩的所有生理过程中发挥重要作用，包括宫颈成熟、胎膜破裂和子宫收缩诱导。妊娠组织产生PGs增加有助于足月和早产分娩的启动。因此，控制妊娠组织中PG合成和代谢的调节机制变得相当重要。


PGs由花生四烯酸在PG H合酶的作用下形成。PG代谢始于NAD⁺依赖性15-羟前列腺素脱氢酶（PGDH）对15-羟基的氧化。该反应使PGs失活形成15-酮代谢物，构成PG代谢的关键步骤。在胎膜中，位于羊膜和蜕膜之间的绒毛膜叶不仅产生PGs，还通过其高PGDH活性控制子宫内活性PGs的浓度。几项研究表明，PGDH的表达和活性在足月分娩绒毛膜中显著下调。在感染相关早产分娩中，PGDH的酶活性和蛋白表达进一步降低。


然而，绒毛膜中PGDH的调节机制在很大程度上仍不清楚。


硫化氢是重要的内源性气体信号转导分子之一，已被牵涉到许多生理和病理过程中，包括血管舒张、血管生成和炎症。硫化氢主要由L-半胱氨酸通过胱硫醚-γ-裂解酶（CSE；酶系统编号4.4.1.1）和胱硫醚-β-合酶（CBS；酶系统编号4.2.1.22）的活性合成。几项研究表明，人类妊娠组织，包括胎盘、胎膜和子宫肌层，表达产硫化氢酶CBS和CSE。最近，我们发现硫化氢在体外抑制人类子宫肌条收缩，并通过抑制宫内组织炎症延长脂多糖诱导的早产分娩，这表明硫化氢参与分娩过程。然而，硫化氢调节妊娠和分娩的潜在机制在很大程度上仍不清楚。


尽管已在人类和大鼠胎膜中鉴定出CBS和CSE蛋白，但CSE和CBS在胎膜中的定位以及硫化氢是否调节胎膜中PG代谢尚未得到研究。在此，我们确定了CBS和CSE在人类绒毛膜中的定位，以及这些蛋白在足月和早产分娩期间的表达水平，并在培养绒毛膜滋养细胞模型中探索了硫化氢对PGDH表达的影响及可能机制。


材料与方法


组织收集


本研究经第二军医大学生物医学研究伦理专业委员会批准。从以下单胎妊娠妇女组中收集人类胎膜：足月未分娩（TNL；n=24）、足月分娩（TL；n=24）和早产分娩（PTL；n=21）。从所有患者获得书面知情同意。TNL组织在择期剖宫产时收集。TL和PTL的胎膜来自自然临产并阴道分娩的无并发症妊娠妇女。有基础疾病证据（如高血压、糖尿病、子痫前期或宫内生长受限）的患者未纳入本研究。


分离绒毛膜叶，并使用倒置相差显微镜监测蜕膜组织的均匀去除。绒毛膜组织在液氮中速冻并储存在-80°C。


免疫组织化学


切取石蜡切片（5 μm厚），复水，并在柠檬酸缓冲液中微波处理以修复抗原。用3% H₂O₂抑制内源性过氧化物酶后，用10%兔血清阻断非特异性抗体结合。然后将切片与针对人CSE和CBS的特异性抗体在4°C过夜孵育。使用生物素-链霉亲和素-过氧化物酶系统（UltraSensitive-SP-kit）以二氨基联苯胺为显色剂检测结合的抗体。用苏木精进行复染。通过用IgG替代一抗进行阴性对照。


绒毛膜滋养细胞培养


根据Kliman等人的改良方法分离和培养绒毛膜滋养细胞。简要地说，从TNL患者获得约40 g新鲜绒毛膜，切碎，然后用0.125%胰蛋白酶和0.02%胶原酶在含0.1%牛血清白蛋白的Dulbecco改良Eagle培养基中分散三次。经Percoll梯度离心后获得纯化的细胞滋养细胞组分。然后将细胞以1×10⁶/孔的密度接种到12孔板中，在含10%胎牛血清的无酚红Dulbecco改良Eagle培养基中于37°C、5% CO₂-95%空气条件下生长。通过使用一抗对细胞角蛋白和波形蛋白进行免疫染色评估细胞纯度。


孵育72小时后，用不同浓度的NaHS和L-半胱氨酸在存在或不存在DL-炔丙基甘氨酸和氨基氧乙酸半盐酸盐的情况下处理细胞4至24小时。在某些情况下，用miR-199a和miR-26b模拟物处理细胞24小时。然后收获细胞并储存在-80°C。


总RNA提取和定量实时RT-PCR


使用TRIzol试剂从绒毛膜组织和细胞中制备总RNA。用oligo(dT)₁₈引物使用M-MLV逆转录酶将RNA（2 μg）逆转录，然后储存在-20°C。PGDH扩增的特异性引物如下：正义链，5'-TTGCACAGCAGCCGGTTTAT-3'；反义链，5'-TTGGCAATCAATGGTGGGTC-3'。使用Rotor-Gene 3000进行定量实时PCR。反应溶液包括2.0 μL稀释的cDNA、每对引物各0.2 mmol/L、200 mmol/L脱氧核苷三磷酸和1×PCR Master Mix。使用SYBR Green作为检测染料。退火温度设定为60°C，扩增循环设定为40个循环。检测PCR产物熔解温度的温度范围设定为60°C至95°C。每个样品根据其β-肌动蛋白mRNA含量进行标准化。使用比较阈值循环（CT）法确定PGDH的相对表达。


使用miRcute miRNA分离试剂盒从绒毛膜组织和细胞中提取总miRNA。使用miRcute miRNA第一链cDNA合成试剂盒合成总miRNA的第一链cDNA。使用miRcute miRNA qPCR检测试剂盒定量miRNA。miR-26b和miR-199a扩增的特异性引物分别为5'-UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU-3'（正向）和5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3'（正向）。每个样品中管家基因U6的扩增作为样品上样和标准化的内参。检测PCR产物熔解温度的温度范围设定为60°C至95°C。使用比较CT法（2^(-ΔΔCT)）确定miRNA表达的相对定量。


蛋白质印迹分析


将绒毛膜组织或细胞在含磷酸酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀分析裂解缓冲液中匀浆。将蛋白质（50 μg）变性并通过12% SDS-PAGE分离，然后通过电印迹转移到硝酸纤维素膜上。将膜在封闭缓冲液中孵育，然后与针对CBS、CSE和PGDH的特异性抗体在4°C过夜孵育；最后与辣根过氧化物酶偶联的IgG（1:1000）孵育。使用增强化学发光蛋白质印迹检测系统可视化免疫反应蛋白。使用Syngene Bio Image系统检测和定量发光条带的强度。为控制取样误差，获得条带强度/β-肌动蛋白的比值以量化相对蛋白表达水平。


PGDH活性测定


通过测量13,14-二氢-15-酮PG F₂（PG F₂的稳定代谢物）来测定PGDH活性。使用商业13,14-二氢-15-酮PG F₂酶免疫测定试剂盒测定培养基中13,14-二氢-15-酮PG F₂含量。标准曲线范围为1000至7.81 pg/mL。


RNA干扰


CSE和CBS的siRNA由GenePharma公司设计和合成。对照siRNA是没有特定靶标的乱序序列。靶向人CSE和CBS的序列如下：CSE正义链，5'-GGCCUUUGCUUCAGGUUUATT-3'；CBS正义链，5'-CGGAACUACAUGACCAAGUTT-3'。使用Lipofectamine 2000将CSE siRNA、CBS siRNA和对照siRNA转染到原代绒毛膜滋养细胞中。然后用10⁻³ mol/L L-半胱氨酸处理绒毛膜细胞。


实时硫化氢产生测量


将约100 mg胎盘组织置于含蛋白酶抑制剂（2 mmol/L苯甲基磺酰氟、1 mmol/L正钒酸钠和10 mg/mL抑肽酶）的磷酸盐缓冲盐水中冰上。将组织匀浆并在4°C离心，然后收集上清液。使用微型硫化氢微呼吸传感器（型号H2S-MRCh，Unisense，Aarhus，Denmark）连接到Unisense PA2000放大器测定硫化氢产生的实时动力学。简要地说，在温控微呼吸室（Unisense）中进行测量。传感器信号稳定后，加入L-半胱氨酸（1 mmol/L）和吡哆醛-5'-磷酸盐（1 mmol/L，硫化氢生成的辅因子）。然后在每个迹线的初始最陡斜率处确定硫化氢产生速率。在某些情况下，加入10⁻³ mol/L CSE抑制剂DL-炔丙基甘氨酸和10⁻³ mol/L CBS抑制剂氨基氧乙酸半盐酸盐。


miRNA靶标的验证


将含有miR-199和miR-26结合位点的PGDH 3'-非翻译区（UTR）片段（600 bp）和突变PGDH 3'-UTR片段插入PsiCHECK2载体中。在不存在或存在miR-199a、miR-26a或miR-26b模拟物的情况下，将上述质粒与绒毛膜滋养细胞共转染。转染24小时后，使用双荧光素酶报告基因检测系统测量萤火虫和海肾荧光素酶活性。将萤火虫荧光素酶活性标准化为海肾荧光素酶活性。


统计分析


所有结果均以平均值±SEM表示。在某些情况下，结果以百分比对照±SEM表示用于说明目的。所有数据均通过Kolmogorov-Smirnov检验进行方差齐性检验。使用单因素方差分析，然后进行Student-Newman-Keuls检验，评估组间显著差异。使用Pearson相关检验检查CSE或CBS与PGDH、CBS或PGDH以及miR-26b或miR-199a之间的相关性。显著性设定为P<0.05。