本研究揭示了碳酸酐酶在乳腺癌中的亚型依赖性作用。通过多组学分析与体内外实验发现，胞外碳酸酐酶在HER2/ErbB2富集型乳腺癌中发挥保护性作用：它们通过加速H⁺跨间质清除，减轻肿瘤微环境酸化，从而促进免疫浸润、抑制肿瘤生长并改善患者生存；而在基底样乳腺癌中则呈相反预后效应。机制上，碳酸酐酶抑制导致瘤内酸化、免疫抑制及糖酵解下调，最终加速HER2阳性肿瘤进展。这一发现提示碳酸酐酶抑制剂在HER2阳性乳腺癌患者中需谨慎使用，同时为该类亚型的预后评估和免疫治疗策略提供了新视角。

图3、碳酸酐酶从根本上改变了乳腺癌组织的pH动态，抑制癌细胞向外界释放净酸，并降低从核心到周边的间质中净H⁺的排出。我们展示了在施加CO₂后，HEPES缓冲的CO₂/碳酸氢根溶液中，A + B平均pH变化曲线（A）以及量化酸化速率（B）。我们还说明了由ErbB2诱导的小鼠乳腺癌组织裂解物，以及碳酸酐酶抑制剂醋唑胺（ATZ，100 μM）和4-氨基乙基苯磺酰胺（AMB，30 μM）对酸化速率的影响。二氧化碳水分含量（n = 4）。数据通过单因素方差分析（ANOVA）比较，随后进行Šidák事后检验。C 为在装载了pH敏感荧光探针羧基-SNARF-1的类器官等轴平面处获取的共聚焦图像。白色轮廓线示出用于量化类器官核心及周边区域pH动态变化的代表性兴趣区域。D-H 鼠源ErbB2诱导型（D–F，n = 8–14）和人源（G + H，n = 8–9）乳腺癌类器官在急性暴露于CO₂/HCO₃⁻后，其细胞外（表面）pH动态变化，相对于无CO₂/HCO₃⁻时的初始平均值。图F显示了类器官核心与外周区域之间的pHo差异及其在CO₂/HCO₃⁻和碳酸酐酶抑制作用下的变化。；图H展示了类似信息，涉及类器官核心与实验培养液之间的pHo差异。I-N  小鼠 ErbB2 诱导型（I-K，n = 6–26）和人源（L-N，n = 8）乳腺癌类器官在急性暴露于 CO₂/HCO₃ 后的细胞内 pH 动态变化，相对于无 CO₂/HCO₃ 时的初始平均值–面板K和N显示了类器官核心与外周区域之间的pHi差异，以及其在CO₂/HCO₃⁻及碳酸酐酶抑制作用下的变化。与斜率=0的线性趋势分析结果无显著差异（图K）或与CO₂/HCO₃⁻相比无显著差异（图N）。图F、H、K和N中的数据通过单因素方差分析（ANOVA）后进行Šidák事后检验或线性趋势分析比较。

图4、抑制细胞内碳酸酐酶可降低小鼠ErbB2诱导的乳腺癌组织中细胞净酸外排能力。A. 刷新分离的乳腺癌类器官在NH₄⁺预脉冲诱导的细胞内酸化及随后恢复过程中的pH平均曲线（n = 6）。实验使用乙酰唑胺（ATZ，100 μM）、4-氨基乙基苯磺酰胺（AMB，30 μM）或等体积DMSO作为溶剂。图右半部分为放大显示的细胞内酸化恢复阶段。 B. 刷新分离自ErbB2诱导的小鼠乳腺癌组织的类器官外周区和核心区的pH随pH变化的净酸外排量。  C. 在最大酸化期间，对应初始pH恢复阶段的固定pH下计算的净酸外排量（n = 6）。  数值表示在向培养液中加入Na⁺以激活Na⁺依赖性转运机制后的阶段。

图5、在体内的醋酸阿托品处理可使小鼠ErbB2诱导的乳腺癌组织微环境呈酸性，降低乳酸浓度，并促进肿瘤生长。使用pH敏感型微电极进行体内pH测量（n = 8），将“核心”定义为电极逐步插入过程中遇到的最酸性区域。实验前30分钟，小鼠经腹腔注射50 mg/kg醋酸阿托品（ATZ）或等量体积的生理盐水。数据通过重复测量的双因素方差分析进行比较。B 为每日腹腔注射40 mg/kg ATZ的小鼠与接受等量生理盐水对照组的尸检肿瘤图像及体内ErbB2诱导的乳腺癌生长曲线示例（n = 17）。数据拟合至二阶多项式函数，最佳拟合参数通过额外平方和F检验进行比较。标尺表示5 mm；两幅图像均以相同放大倍数显示。C–H 通过微透析评估肿瘤糖酵解代谢。在开始给药后1小时测定间质液或血清中的乳酸浓度（C–E）和葡萄糖浓度（F–H）（n = 8–13）。


结论与展望


本研究体内实验中，Unisense pH 500 玻璃微电极被用于直接测量 ErbB2 诱导小鼠乳腺癌的瘤内 pH 剖面。研究者对荷瘤小鼠注射乙酰唑胺或对照后麻醉，小切口暴露肿瘤，将微电极以 1 mm 步进逐层穿刺入瘤体，参考电极置于腹腔，依次记录腹膜表面、4 mm 深度及肿瘤最酸核心区 pH。结果显示乙酰唑胺组肿瘤最低 pH 降至约 6.8，而对照组约为 7.2，证实抑制碳酸酐酶会显著加剧肿瘤微环境酸化。Unisense 微电极凭借其微型尖端实现了对微小瘤内空间的高分辨率 pH 原位测量，为"碳酸酐酶通过加速 H⁺ 跨间质清除、减轻瘤内酸化"提供了直接的在体证据，并将酸化与随后观察到的免疫浸润减少、炎症因子下调及肿瘤加速生长串联起来，构成整个机制论证的关键实验环节。