研究简介:本研究系统探讨了碳酸酐酶（CAs）在乳腺癌发生发展及患者预后中的作用。碳酸酐酶催化 CO₂/HCO₃⁻ 缓冲反应，对 H⁺ 的有效迁移、pH 动态平衡以及细胞酸碱感知具有关键意义，然而其对于癌细胞与基质细胞功能、细胞间互作及患者预后的综合影响此前尚不清楚。该研究综合运用生物信息学分析（涵盖人类蛋白质组学、批量与单细胞转录组学数据，并结合临床病理与预后信息）、离体实验（包括定量逆转录聚合酶链反应、荧光共聚焦显微镜记录细胞内与细胞外 pH、人鼠乳腺癌组织免疫组化蛋白鉴定）以及体内实验（在诱导型乳腺癌小鼠模型中测量肿瘤大小、pH 敏感微电极记录、微透析代谢物分析）开展研究。


结果发现，碳酸酐酶在人鼠乳腺癌变过程中发生显著表达改变。在 HER2/ErbB2 富集型乳腺癌中，胞外碳酸酐酶高表达正向预测患者生存获益，而在基底样/三阴性乳腺癌中则呈负向预测。机制研究表明碳酸酐酶抑制会削弱癌细胞净酸外排以及 H⁺ 从扩散受限区域向肿瘤外周高灌注区域的转运。在体内应用碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺，会使 ErbB2 诱导的小鼠乳腺癌微环境酸化，限制肿瘤免疫浸润（CD3⁺ T 细胞、CD19⁺ B 细胞、F4/80⁺ 巨噬细胞），降低炎症细胞因子（Il1a、Il1b、Il6）及转录因子（Nfkb1）表达，并加速肿瘤生长。同时乙酰唑胺在不影响肿瘤灌注的前提下降低了乳腺组织与血液中的乳酸水平，提示其抑制了发酵性糖酵解。进一步分析显示，HER2 富集型乳腺癌中胞外碳酸酐酶高表达带来的生存获益，依赖于肿瘤的炎症特征。碳酸酐酶通过加速癌细胞净 H⁺ 外排及跨间质 H⁺ 清除，提升乳腺癌内 pH 值，从而在 ErbB2/HER2 驱动的乳腺癌中增强免疫浸润与炎症反应，抑制肿瘤生长并改善患者生存。这一发现为 HER2 富集型乳腺癌的预后评估提供了新视角，同时提示在这类患者中使用碳酸酐酶抑制剂可能需要谨慎考量。


Unisense PH玻璃微电极的应用


采用Unisense pH 500玻璃微电极原位测定小鼠乳腺肿瘤微环境pH，操作时先将完成致癌诱导的小鼠麻醉插管后以呼吸机维持呼气末CO₂稳定，将微电极逐步推进至肿瘤不同深度，取各肿瘤的最低pH值作为其微环境pH表征，且仅纳入实验结束时腹腔pH处于7.1~7.7的样本以保证数据可靠性。依托该高空间分辨率检测技术，研究明确证实口服NaHCO₃可将乳腺肿瘤微环境pH从对照组的6.68±0.04显著提升至7.04±0.09，确证了该疗法对肿瘤局部酸性微环境的中和作用，该结果既是验证干预有效性的核心依据，也与后续肿瘤潜伏期、生长负荷及病理特征无组间差异的发现形成关键对照，为“肿瘤微环境碱化的获益被癌细胞适应性变化抵消”的核心结论提供了关键支撑

图1、在人类乳腺癌组织中，线粒体来源的CA5A和CA5B在各种细胞类型中普遍表达，而非线粒体的碳酸酐酶亚型则主要存在于癌细胞的上皮细胞和内皮细胞中，仅癌相关成纤维细胞和髓系细胞表达CA7。A 以t-SNE图（左）表示的碳酸酐酶总体表达强度，并附有相应的聚类细胞类型（右）。 B 点图显示了人类乳腺癌中碳酸酐酶表达的细胞类型特异性模式。所报告的单细胞测序数据涵盖24,489个癌上皮细胞、6,573个癌相关成纤维细胞、7,605个内皮细胞、35,214个T细胞、3,206个B细胞和9,675个髓系细胞。数据来自Broad研究所托管的在线单细胞门户。 C 点图显示了294例乳腺癌样本中碳酸酐酶蛋白表达水平。数据来自美国国家癌症研究所托管的在线蛋白质组学数据共享平台。CA，碳酸酐酶。

图2、细胞外和胞质碳酸酐酶在HER2高表达的乳腺癌中对预后具有积极预测作用，而在基底样乳腺癌中则对预后具有负面预测作用。图中A–L为乳腺癌患者（n = 860–2053）的生存曲线，按每种乳腺癌分子亚型内细胞外（A–D）、胞质（E–H）和线粒体（I–L）碳酸酐酶mRNA平均表达水平进行分层。


实验结论


碳酸酐酶——尤其是细胞外异构体CA4、CA6、CA9、CA12和CA14。在人类和小鼠乳腺癌发生过程中表现出显著的表达变化。在基底样/三阴性乳腺癌患者中，细胞外碳酸酐酶的高表达与较差生存预后相关；然而，令人惊讶的是，在HER2/ErbB2富集型乳腺癌中，细胞外碳酸酐酶的高表达却与患者的生存率呈正相关。抑制碳酸酐酶可减轻细胞内净酸排泄以及从扩散受限区域向周围和灌注良好的区域排出细胞外H⁺的过程。已提供 在体内，碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺可酸化由ErbB2诱导的小鼠乳腺癌微环境，限制肿瘤免疫浸润（CD3+ T细胞、CD19+ B细胞、F4/80+巨噬细胞），降低炎症性细胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-6）和转录因子（NF-κB1）的表达，并促进肿瘤生长。支持碳酸酐酶的免疫调节作用，与高胞外水平相关，患者生存获益显著。