NO的消耗


由于结果表明nirK在好氧和O₂限制条件下均被转录，因此进行了实验以确定nirK mRNA的增加是否与NirK酶活性的增加相关，通过测量NO的产生来评估。简而言之，在完全好氧条件下生长的细胞或在O₂限制条件下暴露12小时后收集的细胞的水溶液中未检测到NO。尽管如此，我们观察到维诺格拉茨基硝化杆菌细胞悬液以64 nmol min⁻¹ (mg protein)⁻¹的速率快速消耗了2 mM外源供给的NO。热致死细胞悬液中NO转化的速率（图1A）与单独向磷酸盐缓冲液中添加NO时发生的转化速率相同[约27 nmol min⁻¹ (mg protein)⁻¹]，表明NO转化的最大速率依赖于活细胞，非生物消耗也可以以显著速率发生。

图1. N. winogradskyi对NO和O₂的消耗量。从对数生长期后期培养物中通过离心收集N. winogradskyi细胞，洗涤、浓缩后重悬于含50 mM二乙烯三胺五乙酸、pH 7.5的50 mM磷酸钾缓冲液中。在(A)和(B)中，使用安装在全玻璃水套反应容器（体积1.8 ml）内的丹麦Unisense Clark型氧电极，在30°C条件下测定这些终末细胞悬液（OD₆₀₀为0.5，细胞蛋白浓度约36 mg·ml⁻¹）的氧气摄取速率。在下方(A)和(B)中，使用连接至inNO-T测量系统的丹麦Unisense amiNO-600 NO电极在同一反应容器内同步测定NO浓度。在(C)和(D)中，采用连接Prisma QMS-200四极杆质谱仪的膜入口系统同步测定NO（菱形标记）和O₂（方块标记），离子源与电子倍增器检测器均关闭，并记录质量/电荷比（m/z）分别为30（NO）、32（O₂）和40（Ar）的数据。该膜入口系统由一个5 ml水套式Dubinsky腔室组成，中心钻有气体出口孔；样品使用磁力搅拌棒搅拌，温度维持在30°C。O₂和NO信号均以Ar为基准进行归一化处理，以校正采样期间的压力变化；在细胞腔室与检测器之间放置干冰冷阱以去除水蒸气。星号（*）和波浪线（^）分别表示二氧化氮（9 mM）和一氧化氮（NO）的注入时间。A/B组和C/D组中一氧化氮的初始浓度分别为2 mM和3.6 mM。


还进行了实验以确定NO消耗是否与呼吸相关，使用插入同一测定室的O₂和NO特异性电极（丹麦Unisense ）。当向维诺格拉茨基硝化杆菌细胞悬液中添加NO₂⁻时，O₂被快速消耗（图1B）。然而，在添加2 mM NO后，NO₂⁻依赖的O₂摄取受到严重抑制。当NO被完全消耗时，O₂摄取立即恢复到接近初始速率（约90%）。NO依赖的O₂消耗抑制的时间间隔在0.5-32 mM NO范围内是浓度依赖的，NO消耗后O₂摄取总是恢复（数据未显示）。这些结果通过使用气体入口质谱同时监测NO和O₂的消耗得到验证（图1C和D）。向呼吸NO₂⁻的细胞中添加3.5 mM NO后，O₂摄取被抑制超过3分钟（图1D）。在无O₂条件下也监测了NO消耗。在NO₂⁻依赖的O₂消耗耗尽O₂后，消耗7 mM NO所需的时间比O₂充足条件下增加了50%，表明O₂直接或间接影响NO消耗。


由于O₂摄取被NO抑制，进行了实验以确定NO是否抑制亚硝酸盐氧化系统中涉及的主要蛋白质。在分别用叠氮化物（NXR的选择性抑制剂）或N,N-二乙基二硫代氨基甲酸酯（DDC，含铜亚硝酸盐还原酶的抑制剂）处理的细胞中监测O₂摄取和NO消耗。尽管20 mM叠氮化物将NO₂⁻依赖的O₂摄取速率降低了85%，但NO仍被以与未处理活细胞相当的速率消耗（数据未显示）。DDC不影响NO₂⁻依赖的O₂摄取或NO消耗。相反，NO₂⁻依赖的O₂摄取和NO消耗均被1 mM氰化物抑制（图1C）。氰化物处理细胞的NO消耗曲线模拟了单独缓冲液中或在热致死细胞存在下发生的非生物NO消耗（图1A）。


由于氰化物处理细胞不消耗NO，且氰化物先前被证明抑制维诺格拉茨基硝化杆菌"agilis"菌株的细胞色素aa₃氧化酶，NO₂⁻依赖的O₂摄取的停止可能是NO与细胞色素氧化酶结合的结果。其他人报道NO与细胞色素氧化酶的结合是可逆的，当细胞色素氧化酶被还原时，NO的结合速率比其解离速率快多达八个数量级。这与我们的观察一致，即mM浓度的NO在几秒钟内就阻止了NO₂⁻依赖的O₂摄取，但NO的消耗和O₂摄取的恢复需要几分钟（图1D）。反硝化细菌中游离NO的浓度保持在低水平（1-30 nM），NO积累对反硝化菌铜绿假单胞菌NO还原酶缺陷突变体是致命的。尽管NO是已知的有毒物质，可与许多细胞靶标反应，包括血红素、铁硫和含铜蛋白质，但即使在长期暴露于过量NO（125 mM，90分钟）后，维诺格拉茨基硝化杆菌仍保持活力，NO去除后可以氧化NO₂⁻。因此，维诺格拉茨基硝化杆菌似乎具备良好的能力来减轻NO的负面影响。


试图鉴定维诺格拉茨基硝化杆菌NO转化的产物。使用气体入口质谱，在NO暴露前后测量水溶液中NO₂、N₂O、N₂O₄、N₂O₃的浓度。与上述气体浓度相比，非生物对照无显著变化（数据未显示）。由于O₂的存在影响NO消耗的速率，比较了在有和无活细胞存在下NO氧化转化为NO₂⁻和NO₃⁻的情况。当将NO气体添加到仅含缓冲液的瓶顶空并孵育30分钟时，NO被专门氧化为NO₂⁻（图2），如先前观察到的。相反，在维诺格拉茨基硝化杆菌活细胞存在下，大部分NO被转化为NO₃⁻（89%），少数以NO₂⁻形式回收（11%）。从与热致死或氰化物处理细胞悬液孵育的NO瓶中取样的样品含有与缓冲液对照相似量的NO₂⁻，但不含NO₃⁻。

图2. 一氧化氮（NO）向二氧化氮（NO₂）及硝酸盐的化学与生物转化过程。将25微升NO气体（1.1毫摩尔）加入装有5毫升磷酸盐缓冲液(A)（对照组）、含活细胞(B)（LIVE组）、热灭活(C)或氰化物（60 mM）（D组）处理过的温氏奈瑟菌细胞悬液（0.5 OD₆₀₀，约36毫克细胞蛋白/毫升）的7毫升密封小瓶顶空处。添加NO前，先用氮气短暂冲洗密封小瓶顶空。未对小瓶进行强力真空抽吸以维持水相中的氧气浓度，从而支持NO₂依赖性氧摄取。孵育30分钟后，采集上清液样本测定NO₂（灰色柱状图），采用前述比色法（Hageman 和 Hucklesby ，1971）。硝酸盐（黑色柱状图）则根据制造商说明使用Szechrome试剂盒（Polysciences公司）进行比色测定。


与活细胞孵育的上清液中NO₂⁻ + NO₃⁻回收的NO量比仅含磷酸盐缓冲液或热致死和氰化物处理细胞的瓶中测量的NO₂⁻多15-20%。对这一结果的一种可能解释是，随着NO₂⁻通过生物氧化转化为NO₃⁻，NO化学氧化为NO₂⁻的速率加快，从而增加了NO向NO₂⁻ + NO₃⁻的整体转化。如果这种解释是正确的，这意味着即使在NO₂⁻依赖的O₂摄取被NO抑制时，NO₂⁻向NO₃⁻的转化也可能发生。或者，NO衍生的NO₂⁻仅在大部分NO已化学转化为NO₂⁻且部分NO₂⁻依赖的O₂摄取恢复后才被生物氧化为NO₃⁻，这仍然是一种可能性。为区分这些可能性，需要进一步研究，采用不同浓度的NO，并在更详细的时间过程中测量不同无机氮物种的浓度。


基于本研究，提出了NirK在硝化杆菌能量系统中修正作用的模型（图3A）。

图3. N. winogradskyi中NirK功能及NO代谢模型。在氧气存在条件下(A)，大部分电子流向呼吸作用（注意虚线箭头的相对大小表示电子流强度）；在低氧条件下(B)，NirK表达增加，促进依赖二氧化氮的NO生成，并使电子流向还原剂生成方向。过量还原剂通过亚硝酸盐还原和 PHB 合成被消耗，以维持氧化还原平衡状态。 PHB ：聚羟基丁酸酯；Cyt：细胞色素氧化酶； NXR ：亚硝酸盐氧化还原酶；NirK：亚硝酸盐还原酶；I：NADH脱氢酶（复合体I）。


我们假设硝化杆菌通过NirK产生NO来管理细胞的氧化还原状态，并在低O₂浓度不利于O₂依赖的NO₂⁻氧化时可逆控制细胞色素氧化酶活性（图3B），同时NO₂⁻可能仍通过氨氧化积累。几年前提出了NO通过可逆抑制细胞色素氧化酶来调节线粒体呼吸，近期报道表明金黄色葡萄球菌在响应NO对呼吸的抑制时，通过上调乳酸脱氢酶来消耗葡萄糖氧化产生的还原当量以维持氧化还原平衡。关于硝化杆菌，如果细胞色素氧化酶在低O₂条件下被NO抑制（如果我们假设NXR的周转率未被NO完全抑制），从NO₂⁻氧化产生的更多电子可以通过反向电子流引导用于CO₂固定和/或储存产物聚-β-羟基丁酸的还原生物合成。事实上，先前已证明汉堡硝化杆菌在生物膜厌氧区中的细胞比位于好氧区的细胞含有显著更高量的PHB颗粒。我们还观察到NO通过非生物机制以更慢的速率被消耗，并导致NO₂⁻的形成[细胞色素氧化酶对NO的转化也可能导致NO₂⁻的形成]。综合这些数据表明，先前报道的好氧条件下硝化杆菌NO依赖的NADH合成刺激可能只是NO自氧化产生的NO₂⁻代谢的结果。需要对NirK的性质以及硝化杆菌产生和消耗NO进行进一步研究，以试图解决这一长期存在的NO₂⁻现象。


致谢


S.R. Starkenburg获得了俄勒冈州立大学国家科学基金会研究生教育分部地下生物圈综合研究生教育和研究培训（IGERT）资助0114427-DGE的资助。特别感谢Kim Halsey、Allen Milligan和Mike Behrenfeld提供技术援助和使用他们的膜入口质谱仪。特别感谢Kristine Robinson提供NO测量技术援助，以及Joseph Beckman提供有益的科学讨论和使用他的NO。