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摘要

亚硝酸盐氧化α-变形菌纲细菌维诺格拉茨基硝化杆菌主要通过好氧呼吸从亚硝酸盐（NO₂⁻）氧化为硝酸盐（NO₃⁻）中保存能量。近20年前，已有报道在维诺格拉茨基硝化杆菌"agilis"菌株的好氧和厌氧细胞悬液中均发生NO依赖的NADH形成，表明NO氧化可能有助于硝化杆菌的能量保存。近期发现，维诺格拉茨基硝化杆菌Nb-255基因组含有一个基因（Nwin_2648），编码推定的含铜亚硝酸盐还原酶（NirK），该酶可能将NO₂⁻还原为NO。在本研究中，发现推定的nirK在低O₂（0-4% O₂）条件下且在NO₂⁻存在时转录量最高。在无NO₂⁻的厌氧条件下或在NO₃⁻和丙酮酸存在时，未检测到nirK的转录。尽管未能从好氧生长或厌氧孵育的细胞中检测到NO的净产生，但外源NO被活细胞消耗，同时以可逆的、浓度依赖的方式抑制NO₂⁻依赖的O₂摄取。NO₂⁻依赖的O₂摄取和NO消耗均被1 mM氰化物抑制，表明NO消耗涉及细胞色素氧化酶。测量了NO的非生物消耗，但单独缓冲液中、热致死细胞或氰化物处理细胞中NO转化的速率和动力学与活细胞不同。基于这些新信息，提出了一个修正模型来解释NirK和NO如何管理硝化杆菌中的电子通量。

引言

作为化能无机自养菌，维诺格拉茨基硝化杆菌从NO₂⁻氧化中保存能量，并以二氧化碳为碳源固定碳。NO₂⁻氧化是由亚硝酸盐氧化还原酶（NXR）催化的好氧过程，将NO₂⁻转化为NO₃⁻。NXR催化的反应是可逆的，维诺格拉茨基硝化杆菌在厌氧条件下以丙酮酸或甘油为能源时可将NO₃⁻转化为NO₂⁻。尽管维诺格拉茨基硝化杆菌反硝化作用的终产物据报道是一氧化氮（NO）和氧化亚氮（N₂O），但N₂O产生的机制仍未知，因为在维诺格拉茨基硝化杆菌基因组中未鉴定到NO还原酶基因。尽管如此，已从维诺格拉茨基硝化杆菌中纯化出一种与NXR共纯化的蛋白质，该蛋白质可将NO₂⁻还原为NO。此外，在好氧和厌氧细胞悬液中均测量到NO依赖的NADH形成，这导致假设NO可能是亚硝酸盐氧化系统的中间产物。由于NADH是通过NO₂⁻氧化的反向电子流合成的，考虑到NO₂⁻/NO电对（E′₀ = +387 mV）相对于NO₃⁻/NO₂⁻电对（+420 mV）的氧化还原电位较低，NO应该比NO₂⁻更有利于作为电子供体来生成生物合成所需的还原力。

关于NO氧化细菌代谢NO的进一步生理研究尚未见报道。近期对三种硝化杆菌基因组的比较分析表明，每种都含有一个编码推定含铜亚硝酸盐还原酶（NirK）的基因，该酶可能负责NO的产生。有趣的是，硝化杆菌nirK与氨氧化β-变形菌纲亚硝化单胞菌中的nirK为直系同源，并与硝化杆菌近缘α-变形菌纲亲戚红假单胞菌基因组中编码的NirK关系较远。近年来，已投入大量精力来理解NirK在氨氧化菌中的作用。与在厌氧条件下表达并在反硝化中发挥功能的典型亚硝酸盐还原酶不同，欧洲亚硝化单胞菌NirK的表达主要受NO₂⁻浓度和pH控制，而不受NO或O₂控制。NirK在好氧条件下具有活性并表达，使用nirK缺陷型欧洲亚硝化单胞菌菌株的研究表明，nirK在好氧氨氧化过程中对最佳生长和细胞产量是必需的。

在本研究中，调查了维诺格拉茨基硝化杆菌推定nirK（Nwin_2648）的表达，并探索了控制其表达的因素。此外，检查了NO对亚硝酸盐氧化系统的影响，并提出了NirK和NO在维诺格拉茨基硝化杆菌能量系统中的可能作用。

结果与讨论

nirK的表达

进行了实验以确定维诺格拉茨基硝化杆菌是否表达nirK，以及nirK的转录是否受pH、NO₂⁻和/或O₂的影响。将化能无机自养生长的批量培养物中的维诺格拉茨基硝化杆菌细胞悬液在NO₂⁻存在下暴露于不同水平的O₂ 3小时（表1）。随着O₂量的减少，NO₂⁻消耗下降，O₂限制效应明显。例如，暴露于10% O₂的NO₂⁻氧化细胞消耗了9.4 mM NO₂⁻，而给予2% O₂的细胞仅消耗2.1 mM NO₂⁻。关于nirK表达，与欧洲亚硝化单胞菌NirK表达的Western blot分析相反，O₂限制的维诺格拉茨基硝化杆菌细胞比O₂充足细胞含有显著更高量的nirK mRNA。与暴露于20% O₂的细胞相比，当初始O₂浓度分别降至10%、4%和2%时，nirK表达分别增加了4.8、20.3和34.3倍。在暴露于NO₂⁻但无O₂的细胞中，nirK转录量比暴露于NO₂⁻和20% O₂的细胞高20倍，表明在无O₂条件下NO₂⁻有效诱导nirK。与好氧细胞悬液和含NO₂⁻的厌氧细胞悬液相比，在无NO₂⁻的完全厌氧条件下nirK表达显著降低（表1，实验1和2）。当维诺格拉茨基硝化杆菌在NO₃⁻和丙酮酸存在下厌氧孵育时，nirK mRNA量比暴露于20% O₂和30 mM NO₂⁻的细胞低3至50倍。此外，评估了pH对好氧条件下nirK表达的影响（表1，实验3）。虽然细胞在pH 6.6时消耗较少的NO₂⁻，但在pH 6.6-8.2范围内nirK表达无显著差异。

表1. O₂、pH和二氧化氮对nirk表达的影响

将Nitrobacter winogradskyi NB255（ATCC 25391）的批量培养物在化学限定培养基（含750 mM硫酸镁、30 mM硫酸亚铁-EDTA、200 mM氯化钙、1 mM硫酸铜、200 nM Na₂MoO₄、500 nM氯化锰、175 nM硫酸锌和4.2 nM氯化钴）中以石自养方式培养，该培养基含有30 mM亚硝酸钠，并用20 ml/L磷酸盐缓冲储备液（含480 mM磷酸一钾、42 mM磷酸二氢钠，pH 7.8）进行缓冲。

在对数生长早期，通过离心收集细胞，洗涤两次后重悬于无菌磷酸盐缓冲基础培养基（pH 7.5）中，使终浓度达到OD₆₀₀为0.35（细胞蛋白浓度为25 mg/ml）。处理3小时后，使用RNeasy Mini试剂盒从细胞悬液中提取RNA，并按照制造商说明书使用iScript cDNA合成试剂盒合成cDNA。采用Bio-Rad定量PCR检测系统，

在50 mL反应体系中通过定量PCR扩增nirK基因和16S rRNA，循环参数如下：第1循环：95°C预变性30秒；第2–36循环：第一步95°C 30秒，第二步55°C 30秒，第三步72°C 40秒；第37循环：95°C 60秒；第38循环：55°C 1分钟；第39–120循环：初始温度设为55°C，每10秒升高0.5°C。扩增所用引物如下：NWnirK-R 5′-attctcgaagatctgatgc-3′；NWnirk-F 5′-aagaccttctcctacgttcc-3′；NW16s-975F 5′-ggagcatggagcacaggt-3′；NW16s-1157R 5′-gtaagggccatgaggacttg-3′。采用2- DDCT 法将各处理组中nirK转录本的数值相对于16S rRNA进行标准化，并表示为特定处理条件下测得的nirK含量与标准培养条件（实验1、2和3分别在pH 7.2、20% O₂条件下）下的比值。NA：不适用；ND：未检测到。

总之，nirK在低O₂条件下且在NO₂⁻存在时表达量最高。奇怪的是，在无NO₂⁻和O₂时，nirK表达显著低于在含NO₂⁻的厌氧细胞悬液中检测到的nirK mRNA水平，表明厌氧条件下nirK表达是NO₂⁻依赖的。如果NO₂⁻积累到临界诱导水平，维诺格拉茨基硝化杆菌可能在丙酮酸和NO₃⁻存在下经过更长时间的厌氧孵育后表达NirK并产生NO。支持这一假设的是，在厌氧生长后从维诺格拉茨基硝化杆菌中分离出一种有活性的含铜亚硝酸盐还原酶，并且在厌氧条件下低浓度（0.3-0.6 mM）亚硝酸盐时检测到一些通过N₂O的氮损失。然而，我们观察到NO₂⁻不能作为维诺格拉茨基硝化杆菌厌氧生长的唯一末端电子受体，其他人也证明以甘油和硝酸盐分别作为电子供体和电子受体的严格厌氧生长不能持续，因为当NO₂⁻积累到>0.5 mM时，生长受到抑制。此外，在培养开始时用2 mM NO₂⁻处理培养物完全抑制了厌氧生长。因此，如果NirK在厌氧反硝化条件下表达，NirK将NO₂⁻还原为NO的速率必须显著低于NXR将NO₃⁻还原为NO₂⁻的速率。综合这些数据表明，亚硝酸盐还原酶在维诺格拉茨基硝化杆菌经典反硝化能量途径中仅起次要作用，似乎主要在O₂限制环境下的亚硝酸盐氧化过程中发挥作用。