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使用开发的pH微电极研究pHe
一旦观察到开发的pH微电极具有满意的分析性能，它们就被用于测量从癌细胞或正常细胞单层中随机选择的4-6组细胞组形成的pH梯度。作为癌细胞，研究了两种状态下的人结肠直肠腺癌细胞（HT-29细胞）：在正常氧条件下生长和经过12小时低氧处理后。低氧被证明可升高这些细胞中的碳酸酐酶IX水平，这也在我们的实验条件下得到证实（见支持信息）。重要的是，碳酸酐酶是癌细胞细胞外酸中毒的主要贡献者，目前正在作为潜在治疗靶点进行研究。作为正常细胞，研究了两种状态下的人胚胎肾细胞（HEK-293）：未转染和用pFRT/lacZeo载体转染以准备蛋白表达。然而，用pFRT/lacZeo载体转染预计不会影响HEK-293细胞的pH调节。因此，可以预期观察到癌细胞与正常细胞之间以及正常氧条件下癌细胞与低氧条件下癌细胞之间的pHe差异。预计不会观察到正常细胞与用pFRT/lacZeo载体转染的细胞之间pHe的显著差异（因此将这些细胞纳入研究）。
细胞通常在含有多种营养物质并具有一定缓冲能力的溶液中生长和研究。由于这种缓冲能力，细胞的代谢活性仅在相对短的距离（即几百微米）内传播到细胞外空间作为pH变化。因此，测量pHe时需要解决的一个重要问题是将pH微电极以小的已知距离可重复地定位在细胞附近。本研究通过利用伏安pH微电极的优势之一解决了这个问题：与许多其他电化学pH微电极（例如基于质子选择性玻璃或液体离子载体的电位传感器）不同，伏安pH微电极可以使用SECM和将电流信号与所研究表面距离联系起来的接近曲线进行可重复定位。因此，在我们的实验方案中使用SECM将pH微电极向所研究的细胞降低，直到其电流信号（由于氧还原反应）降至本体溶液中观察到的电流的80%。通过将每个实验记录的接近曲线拟合到文献中的分析表达式，确定了在细胞上方测量pHe的精确距离（见支持信息中的详细信息）。根据这些拟合，在距正常氧HT-29细胞平均28±3微米、距HEK-293细胞29±4微米、距低氧HT-29细胞28±4微米和距Flp-In-293细胞24±2微米的距离处测量细胞附近的pH（即pHclose）。然而，重要的是要注意这些距离仍然有些近似。在定位过程中，pH微电极上氧还原反应给出的电流下降，不仅因为细胞的阻塞效应，还因为细胞通过呼吸消耗氧气。在某些情况下，细胞对氧气的消耗是明显的，因为它对定位期间记录的电流信号施加了简单的（漂移）校正。在其他情况下，没有明显的迹象。正如实验部分已经提到的，在将pH微电极额外提升500微米后获取第二个pH值（即pHfar）。
在上述细胞的汇合单层中超过230个位置测量了pHe。当pHclose值汇总并平均时，HEK-293细胞的平均pHe为7.18，Flp-In-293细胞为7.21，正常氧HT-29细胞为7.13，低氧HT-29细胞为7.03。当使用ANOVA分析这些平均值时，低氧HT-29细胞的平均pHe（7.03）被确定为与所有其他平均pHe值显著不同（在0.01的显著性水平）。正常氧HT-29细胞的平均pHe（7.13）被发现与Flp-In-293细胞的平均pHe显著不同（在0.05的显著性水平）。正常细胞（即HEK-293和Flp-In-293）的平均pHe值被发现无显著差异。这些平均pHe值倾向于证实预期：癌细胞的细胞外空间比正常细胞更酸性，具有升高碳酸酐酶IX水平的癌细胞（即受低氧处理的癌细胞）比正常氧癌细胞具有更酸性的细胞外空间。重要的是要注意，这些平均pHe值是在短时间（≤85分钟）内记录的，而本体溶液的pH实际上不受细胞活动的影响。因此，这些pHe值无法用浸入细胞所在溶液的经典大型pH电极观察到。
图5. 在所研究细胞的细胞外空间中发现的pH梯度。具有高于设定阈值（0.4个pH单位）的pH梯度的细胞百分比以红色显示。在 HEK -293细胞单层的59个不同位置、Flp-In-293细胞单层的53个不同位置、常氧HT-29细胞单层的73个不同位置以及缺氧HT-29细胞单层的48个不同位置，评估了细胞产生的pH梯度。同一细胞单层内的各检测点间距为500微米。
图5显示了所研究细胞pHe的更详细图像。这种图像也无法用经典的大型pH电极获得。根据图5，大多数HEK-293、Flp-In-293和正常氧HT-29细胞形成的pH梯度小于0.1个pH单位。然而，大多数研究的低氧HT-29细胞形成的pH梯度在0.1到0.2个pH单位之间，证实了关于低氧肿瘤酸中毒的文献和我们的上述预期。正常细胞从未形成大于0.4个pH单位的pH梯度。作为显著特征，癌细胞（正常氧和低氧）在它们形成的pH梯度方面明显更加异质。约22%研究的正常氧HT-29细胞形成的pH梯度大于0.4个pH单位。有趣的是，仅10%的低氧HT-29细胞形成的pH梯度大于0.4个pH单位，其较低的平均pHe因此是许多细胞具有0.2到0.3个pH单位之间pH梯度的结果。因此，平均pHe值明显掩盖了所研究细胞之间的重要差异。
结论
通过使用还原氧化石墨烯增加其电化学活性表面积从而增加其电流信号，改进了基于丁香醛嗪的伏安pH微电极。所得的pH微电极具有理论灵敏度和良好的稳定性及重现性。
使用SECM将pH微电极定位在距汇合细胞层小的已知距离（24-29微米）处。在距细胞相对较小距离处测量第一个pH值（即pHclose）后，将pH微电极提升500微米，并测量第二个pH值（即pHfar）。然后使用两个pH值计算表征汇合单层约4-6个细胞的pH梯度（考虑到pH微电极电化学活性盘直径仅37微米）。然后使用几个含有癌细胞（HT-29，低氧处理前后）或正常细胞（HEK-293，有和无转染）汇合单层的培养皿，重复该程序超过230次。通过平均给定类型细胞的所有pHclose值计算的平均pHe值证实，受低氧处理的癌细胞确实比正常或正常氧癌细胞具有更酸性的细胞外空间。低氧HT-29细胞的平均pHe显著小于其他细胞的平均pHe值（在0.01的显著性水平）。然而，当分析单个pH梯度（即仅在4-6个细胞上方观察到的梯度）时，细胞之间出现了额外的差异。例如，观察到癌细胞单层形成广泛的pH梯度（从0.1到0.8个pH单位），而正常细胞单层从未形成大于0.4个pH单位的pH梯度。还观察到，低氧癌细胞的平均细胞外pH小于正常细胞，是因为约27%的低氧癌细胞具有0.2到0.3个pH单位之间的pH梯度。同时，正常氧癌细胞的平均细胞外pH小于正常细胞，是因为约22%的正常氧癌细胞具有大于0.4个pH单位的pH梯度。所得结果证明，开发的pH微电极适合以高空间分辨率观察pHe，从而揭示以前无法获得的细胞pH调节细节。所描述的pH微电极和测量pHe的方法可以容易地改进。通过使pH微电极显著更小并使用更先进的SECM装置（例如具有更好分辨率、恒距离模式等），可以在细胞与pH微电极之间更小距离处进行单细胞测量。
支持信息
HT-29细胞受低氧处理后碳酸酐酶IX的表达；使用SECM在细胞外空间中可重复定位pH微电极；pHe测量实验条件下细胞活力；用于研究生物系统的电化学pH微电极的分析性能（PDF）
