在开发新型电化学传感器的过程中，对其分析性能进行全面而严格的评估是验证其能否应用于实际生物体系的关键前提。本研究中构建的基于还原氧化石墨烯和丁香醛嗪的伏安型pH微电极，旨在实现对贴壁生长哺乳动物细胞外pH的高空间分辨率测量。为了确保该传感器能够在细胞水平实验中可靠地反映微环境中的微小pH变化，我们首先对其灵敏度、重现性、操作稳定性以及响应时间等核心指标进行了系统的测试与表征。

ph微电极示意图

图1 ph微电极示意图

灵敏度：接近理论极限的pH响应


传感器的灵敏度是其最基本的性能参数之一。在本工作中，每个pH微电极在使用前均需经过六种已知且具有生物相关pH值（覆盖生理范围）的溶液进行校准。图2展示了典型的校准实验循环伏安图（图2A）以及由此建立的校准曲线（图2B）。该曲线将吸附在微电极表面的丁香醛嗪的形式电位（即阳极峰电位与阴极峰电位的平均值）与溶液的pH值线性关联起来。根据图2B中的线性拟合结果，所开发的pH微电极的灵敏度达到每pH单位60 ± 2.5毫伏（文中数据为60±2.5 mV/pH unit，与理论值对比时文中表述为“非常接近Nernst方程预测的59 mV”，实际计算值为60 mV）。这一数值与能斯特方程对两电子两质子氧化还原反应的理论预测值（59 mV/pH单位，25°C）高度吻合，表明传感器对质子浓度的变化具有近乎理想的响应特性。正是这种高灵敏度，使得传感器能够分辨出细胞外空间中可能存在的细微酸碱度差异。

图2. 将由还原氧化石墨烯和丁香醛嗪构成的pH微传感器浸入已知具有生物相关性的pH溶液中时获得的循环伏安曲线(A)，以及将吸附态丁香醛嗪的形式电位与溶液pH值关联起来的校准曲线(B)。实验条件：作为支持电解质的林格氏缓冲液pH值通过加入1 M盐酸调节至指定值；电位扫描速率为20 mV·s⁻¹。


重现性：批次内与批次间的高度一致性


除了灵敏度之外，传感器在不同制备批次之间的重现性也是决定其实用价值的重要因素。本研究从两个维度考察了重现性：一是同一天内平行制作的5支微电极，二是在不同日期逐一制作的5支微电极。图3分别给出了这两组传感器的平均校准曲线。结果显示，无论是同一批次还是不同批次，各传感器的校准曲线几乎重叠，展现出极佳的一致性。在所有测试条件下，最大的变异系数出现在不同日期制作的传感器用于最高pH值（pH 7.49）溶液时，但即便如此，该变异系数也仅为3%。如此良好的重现性主要归功于形式电位对除pH之外的其他实验条件（如丁香醛嗪的吸附量）不敏感——实验证实，即使吸附量发生变化，在相同pH下测得的形式电位也保持稳定。需要特别指出的是，尽管重现性优异，本研究在实际细胞实验中对每一支微电极均单独进行校准，而非采用平均校准曲线。这是因为哺乳动物细胞单层周围的细胞外pH变化幅度通常很小，使用个体校准能够最大限度地保证测量精度。

图3. 使用同一天内并行构建的五个pH微传感器(A)以及在不同日期分别构建的五个pH微传感器(B)所获得的平均校准曲线。误差条表示标准偏差。


操作稳定性：长时间连续监测的可靠性


在细胞水平实验中，pH微电极需要在多个空间位置依次测量，而移动电极的过程必须缓慢进行以避免扰动细胞建立的天然pH梯度。因此，一次完整的实验（通常在相距500微米的7～8个点位进行14～16次pH测量）大约需要85分钟。这就要求传感器在数小时内具备稳定的信号输出。为了评估操作稳定性，我们将一支微电极交替浸入两种已知pH值的林格氏缓冲液中（实际pH分别为7.34和6.98），并以10分钟为间隔连续记录其读数，持续近3小时。如图4所示，传感器初始报告值与实际值完全一致（7.34 vs 7.34；6.97 vs 6.98）。随着时间的推移，虽然读数略有下降趋势，但在整个3小时监测期内，报告值与初始测量值之间的偏差始终不超过0.05个pH单位。这一结果表明，所开发的pH微电极足以在至少3小时的实验窗口内稳定工作，并能可靠地捕捉到大于0.05 pH单位的任何变化。


图4. 使用一种开发的pH微传感器对两种具有生物学相关pH值的溶液随时间变化的pH值报告结果。实验条件：使用1 M盐酸将林格氏缓冲液的pH调节至指定值；该pH微传感器首先用于测定高pH值溶液的pH值，随后以10分钟为间隔测定低pH值溶液的pH值。


响应时间：快速获取pH信息


由于该微电极是基于循环伏安法进行测量的，其响应时间取决于完成一次伏安扫描所需的时间。在本文采用的20 mV/s电位扫描速率下，在一个适合氧化和还原丁香醛嗪的电位窗口内记录一张完整的循环伏安图仅需45秒。如果需要更快的响应速度，可以通过提高电位扫描速率来进一步缩短扫描时间，从而实现亚分钟级的实时pH监测。


与其他微传感器的性能比较


为了全面评价本传感器的优势，我们在论文的支持信息中将上述分析性能与文献中已报道的其他电化学pH微传感器进行了对比。总体而言，本传感器在灵敏度、重现性和稳定性方面均达到了同类器件的先进水平，并且兼具伏安法可精确定位（借助扫描电化学显微镜）的优点，弥补了传统玻璃基或离子载体基微电极脆弱、响应慢、寿命有限等不足。


结论：适用于高分辨率细胞外pH研究的理想工具


综合以上分析性能的评估结果，可以得出结论：基于还原氧化石墨烯和丁香醛嗪的伏安型pH微电极不仅具有接近理论值的灵敏度、优异的批次内与批次间重现性，而且在长时间连续测量中表现出良好的稳定性，响应时间亦可满足动态监测的需求。这些特性为其后续成功应用于癌症细胞与正常细胞外pH的高空间分辨率测量奠定了坚实的基础。正是凭借这套可靠的传感器平台，我们得以揭示传统宏观pH电极无法捕获的细胞异质性信息，从而为肿瘤代谢研究及药物筛选提供了新的技术手段。