全球领先的微电极研究系统

我们之前报告的经皮测量都是在皮下植入小鼠模型上进行的，其中H₂扩散到皮肤表面的路径长度仅通过小鼠背部非常薄的皮肤。在这里，我们已经证明一些H₂通过包括覆盖尺骨的薄肌肉在内的皮下组织渗透，以在表面进行测量。与皮下小鼠模型中植入Mg合金产生的H₂相比，该皮肤表面的H₂水平低得多，在小鼠模型中H₂只需渗透薄的小鼠皮肤即可到达表面。我们将较低的浓度归因于兔子皮肤比小鼠皮肤的渗透性更低，这可能是由于皮肤厚度的差异。小鼠全皮的厚度约为0.7 mm，而兔子约为2 mm，或约厚3倍。此外，与小鼠模型中的皮下植入相比，Mg合金植入得更深。因此，预期覆盖植入物的肌肉中的血流会在H₂扩散通过组织时带走一些H₂，进一步降低皮肤表面的H₂浓度。

作为对照，在没有Mg植入的兔子骨上进行H₂测量。骨髓和皮下组织中的H₂浓度分别为6±3 μM和5±2 μM。按压兔子皮肤时H₂浓度为2±1 μM，而仅轻轻触碰兔子皮肤时未检测到H₂。对照兔子中的这种兔子皮肤背景水平与小鼠皮肤对照实验中的背景水平1.0-7.3 μM相似。

由于针式传感器的针尖是倾斜的，除非以一定角度按压到皮肤上使倾斜表面与皮肤齐平，否则它无法捕获在触碰点通过兔子皮肤渗透的所有H₂。因此，还使用电化学H₂玻璃毛细管传感器（H₂-50）测量孔上方兔子皮肤的H₂渗透性。H₂玻璃毛细管传感器的传感器尖端是扁平的，直径约50 μm，比H₂针式传感器（1.6 mm）小得多。由于玻璃传感器的小而扁平的尖端，它可以紧密接触皮肤并每单位面积捕获更多H₂。将传感器垂直于皮肤并保持足够压力以轻微压下皮肤，获得了非常可重复的读数，这在我们早期的小鼠研究中也发现了。事实上，使用玻璃传感器测量的H₂浓度高得多。仅轻轻触碰覆盖预钻孔的兔子皮肤时，H₂浓度为62±10 μM，比前面提到的相同条件下针式探头的浓度（12±5 μM）高约5倍（p=0.0001）。如果玻璃传感器按压在兔子皮肤上，H₂浓度会更高。然而，由于玻璃毛细管传感器的脆弱性，我们没有将其按压在皮肤上。玻璃毛细管传感器可以通过简单触碰皮肤轻松检测低浓度的H₂。此外，玻璃传感器探头给出了皮肤表面H₂浓度的更准确读数，因为由于与皮肤接触不良，相当数量的H₂通过针式探头逃逸测量。因此，为了通过经皮低H₂浓度测量更好地评估Mg合金的降解，推荐使用H₂玻璃传感器。

图3c显示了植入后2周使用H₂针式传感器对7只兔子的测量结果。骨髓中的H₂浓度已降至1058±158 μM。皮下组织和按压兔子皮肤的H₂浓度分别为187±96 μM和94±48 μM。轻轻触碰皮肤的H₂浓度为5±3 μM。与第一周测量相比，所有这些不同部位的H₂浓度都较低。与第一周测量相比，骨髓（p=0.0115）、皮下（p=0.0013）和轻轻触碰皮肤（p=0.0080）中的H₂浓度显著降低。然而，植入后1周和2周轻轻按压兔子皮肤的H₂浓度没有显著差异（p=0.3406）。骨髓、皮下组织和按压兔子皮肤中的较低H₂浓度表明第二周Mg合金的降解速率较低。螺钉板系统在第一周比之后更快的降解行为也在LAE442合金的体外骨模型中观察到。这种H₂生成的减少是由于Mg(OH)₂和MgCO₃越来越厚的腐蚀层的形成导致腐蚀减慢，这已被证明覆盖植入物表面。虽然与第一周相比，植入后2周的H₂生成减少，但骨髓中的H₂浓度仍高于H₂饱和水溶液。

表1接骨板与螺钉的体积变化

MicroCT分析显示，4周终点时钢板体积从加工后的57.5 mm³降至57.1±0.6 mm³，总体积平均减少1%（n=3）（表1）。螺钉体积从加工后的9.7±0.4 mm³（n=8）降至4周终点的8.6±0.6 mm³，总体积平均减少11%（n=12）。由于装置间测量的偏差较低，植入前仅扫描了一个加工后的钢板和四个加工后的螺钉。8周终点时，钢板体积为54.3±4.0 mm³（n=4），螺钉体积为7.8±0.4 mm³（n=4）。由于技术错误，8周时间点的一个螺钉无法分析。与钢板相比，螺钉显示出更大的体积损失，这与Chaya等人观察到的相似。这可能是由于与钢板相比螺钉的表面积/体积比增加，特别是在螺纹轴区域，也可能由于骨髓空间（螺钉所在位置）与底层肌肉空间（钢板所在位置）相比流体流动的增加。螺钉中观察到的增加的体积损失也支持了骨髓空间与皮下组织相比测量的H₂浓度更高。

图4. 肱骨截骨术后4周取出并采用镁合金钢板及螺钉固定后的代表性微计算机断层扫描（microCT）横截面图像。截骨部位(o)仍清晰可见，但骨痂形成亦显见(c)。氢气监测孔(h)现已完全被骨组织填充。钢板（实线箭头）与螺钉（虚线箭头）均出现材料降解现象（n = 3）。

MicroCT样品的定性评估与定量评估相关（图4）。截骨部位（o）在术后4周仍然可见，为插入H₂传感器进入骨髓空间而创建的孔（h）也是如此。然而，到术后4周，H₂传感器孔已被矿化组织填充，这将阻止此时及以后的测量，这是未来研究的重要考虑因素。钢板上几个位置注意到明显的点蚀腐蚀（实线箭头），而螺钉上注意到更均匀的腐蚀，特别是螺纹部分和螺钉轴远端的损失（虚线箭头）。注意到骨痂形成和骨过度生长（c），这在使用该手术模型的其他研究中也有观察到。

本研究的局限性包括无法将H₂浓度外推到特定的降解速率，这可能长期有助于使临床相关信息影响决策。H₂监测技术按目前的方式进行是侵入性的，需要麻醉才能进行骨髓和皮下测量。未来的发展可能侧重于创建侵入性较小的方法，以对不同组织环境中的H₂浓度进行更全面的表征。不同浓度H₂气体对各种受影响细胞群体的影响也尚不清楚。未来研究可能涉及体外工作，以了解不同H₂浓度影响的机制，以及评估具有不同降解速率的Mg合金，以确定所描述的H₂监测技术确定降解速率差异的能力。此外，由于成本低，未来实验中将考虑X射线分析。将执行更多中间测量时间点，以提供有关装置降解、骨再生和H₂气腔发展的额外临床信息。

结论

通过电化学H₂传感器研究了兔尺骨骨折固定模型中Mg合金的降解。骨髓中的H₂浓度远高于之前使用皮下小鼠模型经皮测量Mg合金的体内研究。这些结果表明，骨髓内Mg螺钉段降解产生的H₂被截留在骨髓中。发现板上方的皮下组织中H₂浓度显著但低得多。虽然通过在植入物上方皮肤表面进行无创经皮测量获得的H₂浓度较低，但当按压在皮肤上时，电化学H₂传感器能够充分检测这些水平的H₂。这些结果证实，骨骨髓中的Mg以易于测量的速率腐蚀，且骨对H₂的渗透性低于周围组织，导致骨内部H₂的积累。H₂传感有望成为监测体内Mg合金降解的有效手段，适用于比小鼠更大的测试动物和人类患者。基于这些数据，出现了许多生物学问题，例如H₂是否对愈合环境的任何组分有影响。H₂气体积累是否影响细胞外基质、细胞、细胞信号传导？还是它是一种无害的元素？关于H₂气体生物学效应的进一步研究是进一步确立可植入Mg装置生物学效应的关键。

致谢

作者感谢国家科学基金会（NSF ERC 0812348）的财政支持。感谢Samer Zaky博士的外科支持，以及Kostas Verdelis博士和Rong Chong提供的MicroCT协助。