2.3 电化学H₂传感器测量H₂


使用两个电化学H₂传感器（Unisense，Aarhus，Denmark）进行H₂测量，它们通过在工作电极上施加电压并测量H₂氧化产生的电流来在安培模式下运行。一个传感器配备针式传感尖端（尖端直径1.6 mm，H₂-NP），用于穿透兔子皮肤的测量，如骨髓内部和皮下组织，以及通过按压或轻轻触碰尖端到兔子皮肤进行的一些经皮测量。另一个传感器配备扁平玻璃毛细管尖端（尖端直径50 μm，H₂-50），用于通过按压或轻轻触碰尖端到兔子皮肤进行的经皮测量。安培微传感器连接到万用表进行测量（Unisense，Aarhus，Denmark）。H₂传感器经过校准，万用表读数通过使用我们早期报告的方法由H₂饱和水稀释制备的标准品生成的校准曲线从微传感器电流转换为H₂浓度。大于饱和水中浓度的H₂浓度根据校准曲线外推到更高浓度来确定。


对于体内测量，H₂传感器通过在动物之间浸入70%乙醇中5分钟进行消毒。兔子使用氯胺酮和赛拉嗪镇静，并使用异氟烷（通过面罩输送）麻醉。兔子保持在加热台上，微传感器尖端用微操作器定位进行测量，如图2c所示。通过在手术假对照兔子（无截骨术或Mg植入）的骨髓内部（使用在板和螺钉近端创建的监测端口）和皮下组织插入针式传感器尖端，或仅将扁平毛细管传感器尖端触碰在皮肤上，进行H₂传感的对照测量。所有兔子在术后1周和2周都进行了测量。


通过用H₂针式传感器在纹身标记处穿透皮肤，然后轻轻推动它穿过组织并进入骨中预钻的孔中进行骨髓测量，如图2a和b所示。然后通过将传感器尖端从骨和底层组织中撤回，使其与皮下空间接触，进行皮下组织测量。最后，通过将H₂传感器尖端（针式或扁平毛细管）按压在孔上方的皮肤上，在植入物上方的皮肤上无创测量H₂。这最后一种测量程序与我们早期报告中描述的经皮无创测量类似。经皮测量使用了两种技术：将传感器尖端按压到皮肤上以确保与皮肤良好接触，以及仅轻轻将传感器尖端触碰皮肤。虽然每次测量仅需约30秒即可达到稳态信号，但通过等待90秒或更长时间可以获得更稳定的H₂信号和更好的精度。


2.4 微型计算机断层扫描表征


截骨术和固定装置植入后4周（3只兔子）或8周（4只兔子），兔子被安乐死，桡骨/尺骨复合体被取出并在福尔马林中固定3天。假对照兔子未被安乐死。微型计算机断层扫描表征按照Chaya等人描述的方法进行。微型计算机断层扫描以10 μm体素大小、60 kVp束能量、400 ms曝光、每个视图平均10帧和360度扫描角范围进行（Skyscan 1172，Bruker-Skyscan，Belgium）。原始扫描文件然后使用Recon重建，并使用CTAn（Skyscan）分析。通过手动定义所有螺钉和板周围的感兴趣区域，然后设置上下阈值水平进行二值化，将装置与周围软组织和硬组织分离，来测量装置体积。下阈值水平通过选择软组织与背景直方图曲线的最大值和Mg装置直方图曲线的最大值之间的拐点来确定（平均58±4 a.u.）。还获得了三维重建和横截面视图用于定性评估。


2.5 统计分析


除非另有说明，所有数据均以平均值±标准差（SD）表示。对于Mg合金腐蚀产生H₂的统计分析，对7只实验兔前臂和1只假兔前臂进行测量。统计分析使用GraphPad Prism 3软件（GraphPad Prism Software, Inc.）进行。通过学生t检验评估同一位置在不同时间点和不同传感器测量之间差异的统计显著性。P值小于0.05被认为具有统计学意义。


结果与讨论


本研究的总体目标是表征临床相关动物模型中功能性Mg植入系统周围环境中的H₂浓度。具体而言，本研究确定H₂在骨折固定模型的骨髓内高浓度积累，然后在周围皮下空间降低，并在皮肤表面进一步降低。此外，该模型中测量的H₂浓度显著高于饱和溶液中的H₂浓度。


钢板和螺钉的手术植入对所有兔子来说都是顺利的。然而，一只兔子在术后第3天被发现死于笼中，原因不明。这只兔子被指定为4周终点，因此被排除在进一步评估之外。所有其他兔子愈合过程顺利，在上述镇痛和抗生素治疗下未表现出痛苦或感染迹象。


植入后1周，将尖端定位在骨髓中、皮下组织中、按压皮肤和轻轻触碰皮肤时H₂传感器的响应如图3所示。图3a显示了使用H₂针式传感器在单只兔子上的单次测量的代表性传感器响应信号。传感器响应信号是H₂氧化产生的电流随时间变化，传感器被定位在四个测量部位。信号最初非常小（约40 pA），当传感器在空气中保持约40秒时为平坦背景；然后传感器缓慢穿过皮肤并进入骨孔上方的组织，在此期间信号逐渐增加到约250 pA，因为它被推入组织更深，表明随着接近骨孔H₂浓度增加；当进入孔中时信号然后表现出突然增加，在那里保持位置；最后，信号趋于稳定值约1400 pA，反映了骨髓中高得多的H₂浓度。约200秒后，传感器从端口撤回，导致传感器信号急剧下降，并定位在端口上方的皮下空间中，信号趋于稳定值（约300 pA），与传感器被推入端口之前获得的值相似。约300秒时，传感器从兔子皮下组织中撤回，导致信号下降到背景。然后，将尖端 firmly 按压在钻头孔上方的皮肤上进行测量，当传感器就位时信号从背景增加并趋于约一半的值（约150 pA），与在皮下组织中时相比。最后，约400秒时，传感器仅轻轻触碰皮肤，信号下降到与初始背景信号相当的低值。使用其他传感器获得了相同的信号响应模式。


图3. 使用镁合金装置对麻醉家兔进行氢气浓度测量结果。(a)植入一周后，同一只代表性家兔骨髓、皮下组织以及通过按压皮肤并轻触皮肤（从左至右）经皮途径测得的氢气浓度随时间变化的传感器电流信号。(b)根据校准曲线计算得出的七只家兔在上述四个时间点的平均氢气浓度。(c)植入两周后所有七只家兔使用镁合金装置测得的平均氢气浓度。误差条表示对七只家兔测量值的标准偏差（n = 7）。


图3b是汇总所有7只实验兔在这4个不同位置（从左到右依次为骨髓中、皮下组织中、经皮按压皮肤和轻轻触碰皮肤）使用H₂针式传感器测量结果的柱状图。对于此图，原始传感器电流信号通过校准曲线转换为H₂浓度。


H₂针式传感器能够在植入后1周轻松检测骨髓中的H₂，当时浓度为1460±320 μM，如图3b所示，即使没有观察到可见的气腔。骨髓中出乎意料的高H₂浓度是一项重要发现。该水平超过了我们报告的皮下小鼠模型中非常快速生物降解Mg合金经皮测量的最高水平，并超过了H₂饱和水溶液中的浓度800 μM。这种非常高的H₂浓度表明，骨髓中四个螺钉段原位生成的一些H₂被截留在骨髓中，推测是由于通过骨髓空间和周围骨骼的缓慢渗透。超过H₂饱和水的测量浓度水平表明组织可能已饱和H₂，且截留在骨髓中的一些H₂也以气泡形式存在，其H₂浓度可以高得多。由于传感器将测量溶解和气体中的H₂，高水平归因于气体的贡献。它还表明骨髓中H₂的生成速度快于其溶解在骨髓中并通过骨骼渗透或扩散到测量孔和骨折间隙逃逸的速度。这些结果证实Mg确实在骨髓中生物降解，且H₂从骨髓中的运输相对缓慢。与骨中Mg植入物相关的H₂气体也被其他研究人员观察和评论。Witte等人观察到植入骨中Mg合金相邻组织中的气泡，并将其归因于H₂的广泛扩散。Huehnerschulte等人未观察到气泡，称"...气体没有离开髓腔，而是在其中积累"。Wolters等人使用常规H₂捕获技术研究了钢板螺钉系统的体外H₂生成。然而，尚未有直接在骨髓中进行H₂体内测量的报告。


相比之下，孔上方骨相邻皮下空间中的H₂浓度为550±210 μM，或约低3倍。为获得这些结果，将传感器尖端从进入孔撤回至孔上方的皮下空间，使探头尖端距离孔和固定板末端大致等距。该区域检测到的H₂可来自三个来源：通过孔从骨髓逃逸的H₂、由最接近孔上方探头尖端的板末端降解形成并扩散到探头尖端的H₂，以及从骨髓内腐蚀通过骨和覆盖肌肉渗透的H₂。其中最不可能的是通过骨的渗透，鉴于骨髓中发现的高浓度，骨似乎对H₂的渗透性更低。


当电化学传感器撤回然后按压在兔子皮肤上时，H₂浓度降至120±50 μM，在植入物正上方无创直接测量。该测量表明一些H₂从植入物通过皮下组织和兔子皮肤渗透到表面，且H₂渗透到皮肤表面的路径长度对测量的H₂浓度有显著影响。对于使用针式探头在表面进行的经皮测量，我们发现施加在探头上的压力程度显著影响H₂信号。当探头仅轻轻触碰覆盖预钻孔的兔子皮肤时，测量的H₂浓度降至仅12±5 μM。虽然测量在同一位置，但表观浓度与按压兔子皮肤相比下降了约10倍。我们将其归因于针式探头尖端开口的倾斜表面，这使得难以确保与皮肤表面完全接触，因此H₂无法通过探头和皮肤之间的任何间隙逃逸。H₂传感器上的压力影响H₂测量；压力越大，H₂传感器捕获的H₂越多，给出的信号越高。因此，传感器尖端按压皮肤时测量的较大浓度更能代表皮肤表面的真实H₂浓度。