摘要


镁（Mg）医疗器械目前正在骨科应用中进行市场推广，其降解过程复杂，包括氢气（H₂）的释放。H₂暴露对相关细胞类型的影响尚未得到研究；且降解Mg装置周围的浓度尚未被定量，以支持此类机制研究。测量Mg植入物周围不同微环境中H₂浓度的简单有效方法是理解H₂对这些细胞生物学影响的第一步。在此，我们展示了体内骨折固定装置周围H₂的体内测量。电化学H₂微传感器在三个解剖部位检测到H₂水平升高，响应时间约为30秒。传感器显示，植入后1周骨髓中的H₂浓度（1460±320 μM）远高于皮下组织（550±210 μM）和皮肤表面的测量值（120±50 μM）。此外，骨髓中测量的H₂浓度超过了H₂饱和水溶液中的浓度（约800 μM）。这些结果表明，骨内Mg植入物降解过程中释放的H₂通过骨髓，并由于通过骨骼的缓慢渗透而至少部分被截留。本研究首次确定了骨髓环境中的H₂浓度，并将使体外实验能够在临床相关H₂浓度下进行，以探索H₂暴露可能的生物学效应。


意义声明


使用电化学H₂传感器监测兔尺骨骨折模型中Mg骨折固定系统的降解。有趣的是，骨髓中的H₂浓度比H₂饱和水溶液高82%。这表明原位生成的H₂被截留在骨髓中，且骨骼比周围组织的渗透性更低。兔子皮肤上可检测到的H₂也证明了H₂传感器监测薄层组织下降解过程的能力。H₂传感有望成为监测体内Mg合金降解和创建体外测试平台的工具，以更机制化地评估不同H₂浓度对成骨相关细胞类型的影响。


引言


用于骨折固定的可生物降解植入物相比当今广泛使用的永久性不锈钢和钛装置具有许多优势。重要的是，基于可生物降解材料的植入物在骨愈合期间提供机械支撑，并在再生骨强度充分增加后的某个时间设计为降解，如果发生并发症，消除了以后手术移除装置的需要。镁基合金由于具有良好的生物相容性、合适的降解速率以及与皮质骨相似的机械性能，是可生物降解植入物用于骨折固定和其他骨科及颅颌面应用的有前景候选材料。除了在为骨再生提供机械强度外，Mg合金还被发现比钛和聚合物对照装置更能增强骨再生。


已知Mg及其合金在水性环境中降解，生成镁离子（Mg²⁺）和金属合金元素离子、氢氧根离子（OH⁻）以及氢气（H₂）。


Mg + 2H₂O → Mg²⁺ + 2OH⁻ + H₂↑


Mg及其合金已用于临床前动物研究，评估使用钢板、螺钉和销钉等不同装置的骨折固定和ACL移植物固定。这些研究使用放射学（微型计算机断层扫描和X射线成像）和组织学方法的组合来评估Mg装置的降解及其对周围组织和细胞的影响。其中一些研究描述了Mg植入物周围气体囊的积累。然而，H₂气体的生成未被测量，其在植入物周围各种组织中的分布也未被评估。此外，通过荧光成像测量了体内植入Mg装置周围的pH变化，但这种方法需要注射荧光染料半萘并罗丹明荧光素。


几个研究小组已将Mg装置降解速率外推至体内细胞观察到的Mg²⁺浓度，开始探索Mg装置周围观察到的增强骨再生背后的分子机制，这突出了理解和识别愈合环境中合金各种降解产物存在的重要性。然而，尚未存在评估H₂对骨折愈合相关细胞（成骨细胞、破骨细胞、骨髓基质细胞等）行为影响的研究。


由于每降解一个金属Mg原子就会释放一个H₂分子，测量释放的H₂可以直接反映Mg的降解。除了能够在机制研究中定义生物环境中Mg合金的降解产物外，对植入体内Mg装置降解的直接无创测量还将能够进行监测，以确保考虑到相关骨再生，装置降解正在适当进行。Mg装置降解的监测通常通过放射学测量（如微型计算机断层扫描（MicroCT）和X射线成像）在体内进行，然而这些技术需要大型设备和X射线吸收暴露，且其灵敏度有限。MicroCT可用于体内成像，但通常仅用于小动物模型。


最近，我们已经证明，使用体内电化学H₂传感器测量皮下植入的Mg及其合金降解产生的H₂是一种简单有效的无创方法，用于小动物模型中经皮监测H₂浓度。在植入合金上方的皮肤表面测量的H₂浓度与取出植入物的重量损失成正比。Mg合金的降解速率越快，检测到的H₂浓度越高。该方法采用了高灵敏度的H₂电化学传感器，并依赖于H₂通过皮肤的高渗透性。虽然该方法在将观察到的H₂浓度转化为降解速率方面有效，但这些研究未评估植入骨环境中的功能性装置，其中复杂组织不同的H₂扩散速率可能影响H₂的积累。


本研究旨在使用H₂气体的电化学传感器监测兔尺骨骨折模型中Mg骨折固定系统的降解。对植入物周围不同组织环境中H₂分布的更全面和定量评估可能有助于更好地理解Mg装置周围观察到的增强骨再生背后的机制，以及导致H₂降解副产物积累与分散的因素。完成本研究将作为建立测试平台的第一步，用于在临床相关H₂浓度下评估H₂暴露对暴露于降解Mg装置的细胞群体的影响。


实验部分


2.1 装置设计与制造


装置制造过程遵循我们早期的程序。Mg棒材（99.9% Mg，Goodfellow，PA）经过CNC加工，生产带有四个固定螺钉孔的固定板（4.5×20 mm）和长度为7 mm、轴外径为1.75 mm的螺钉。加工后的固定板然后用400、600、800和1200目金刚石膜抛光。抛光后的固定板和加工后的螺钉然后在甘油、乙酸和硝酸的溶液中酸蚀10-15秒，以使表面特性均一化。植入前，固定板和螺钉接受γ灭菌，剂量为20 kGy，剂量率为23.5 Gy/min（Mark I 68，JL Shepherd and Associates，San Fernando，CA）。


2.2 手术植入


兔尺骨骨折模型被用于评估功能性骨科应用中Mg装置的降解，因为它在文献中已得到充分确立，并且我们团队之前已使用过。所有动物实验和程序均经匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会批准，并按照NIH实验动物护理和使用指南进行。研究共使用9只新西兰白兔（12周龄，Charles River Laboratories，Wilmington，MA）。九只动物中八只的右或左尺骨在制造截骨术后接受固定板和螺钉的手术植入，一只兔子作为假手术对照，未制造截骨术或植入固定板和螺钉（图1）。

图1. 各评估时间点的实验时间线及样本量。本研究共纳入9只兔，其中8只分配至实验组接受截骨修复术，1只作为假手术对照组未接受截骨或修复术。*术后第3天，1只兔死亡并退出H2监测程序；研究终点设定为第4周。


手术前，兔子使用氯胺酮和赛拉嗪镇静，插管并使用异氟烷麻醉，前臂剃毛和消毒。用手术刀解剖覆盖尺骨的皮肤和肌肉，抬起和牵开覆盖的肌肉，以便对尺骨进行外科操作。在每只实验兔中，使用旋转钻头在尺骨中点进行截骨术，造成约1 mm近远向长度的缺损，并贯穿尺骨的全宽和全高。然后通过用手持钻钻4个导向孔（截骨部位两侧各2个），将板放置在截骨部位上，并用4个螺钉固定，使所有螺钉啮合尺骨两侧的皮质骨，如图2a和b所示。然后使用手持钻在Mg板近端和远端通过前皮质壁创建2 mm钻头孔，以便用传感器监测H₂的释放。然后使用可吸收Vicryl缝线分层闭合覆盖的软组织，并用纹身标记H₂监测端口在皮肤上的位置。对一只兔子进行假手术，未进行截骨术和随后的钢板螺钉固定，但为H₂监测创建了钻头孔。

图2。(a)示意图展示了将镁固定板通过四枚穿透骨髓内部的镁螺钉固定于骨折尺骨上的位置。尺骨截骨处（骨折部位）由垂直虚线标出。传感器测量时需将探头尖端穿过组织并插入右侧所示骨组织上的预钻孔中（该示意图未按比例绘制）。(b)植入阶段用于骨折固定的镁装置照片。氢气传感测量孔位于固定板右侧（蓝色箭头标示处）。(c)安装在微操作器上的氢气微型传感器，用于测量植入兔尺骨中的镁合金中的氢气浓度。（关于图例中颜色标注的说明，请参阅本文网络版内容）。


所有兔子术后接受Ketophen镇痛，每天两次，持续3天，以及Baytril抗生素覆盖，每天两次，持续3天。兔子术后还佩戴伊丽莎白颈圈，以防止咀嚼缝线，直到切口部位愈合（术后约10天）。兔子监测一般行为、运动以及食物和水摄入，标准饮食和标准丰富化从术后立即开始。兔子每天监测跛行、嗜睡、伤口裂开和感染迹象。此术后护理程序在手术植入以及H₂监测后进行。