研究简介:本研究针对实体瘤酸性微环境这一cancer hallmark，探讨了口服碳酸氢钠（NaHCO₃）缓冲疗法在小鼠乳腺致癌过程中的作用。酸性肿瘤微环境由癌细胞高糖酵解产生大量乳酸和H⁺、经酸-碱转运蛋白外排及灌注不足共同造成，既往研究显示口服NaHCO₃可提高肿瘤pH、减少转移并防止复发，且在TRAMP前列腺癌模型中延缓原发瘤发生，但其在乳腺上皮恶变过程中的作用尚不明确。研究人员对雌性C57BL/6j小鼠采用二甲苯并蒽（DMBA）灌胃联合甲羟孕酮植入的方式诱导乳腺癌，自诱导开始即给予含200 mM NaHCO₃的饮水或普通饮水。结果显示：口服NaHCO₃确实显著提高了体内乳腺肿瘤的微环境pH（从6.68±0.04升至7.04±0.09），同时也升高了尿液、动脉血pH及碳酸氢根浓度，证实系统性碱化效果。


然而出乎意料的是，NaHCO₃组小鼠肿瘤中位潜伏期（85.5±8.2天）与对照组（82.0±7.5天）无显著差异，肿瘤负荷、组织病理学类型分布亦未受影响。机制层面研究发现，NaHCO₃治疗虽然未改变NBCn1和NHE1的蛋白表达量，但通过翻译后调控增强了乳腺组织的净酸外排能力，该能力与肿瘤潜伏期呈负相关；同时提高了正常乳腺和癌组织中上皮类器官的稳态细胞内pH（约0.15个单位）。功能实验表明，NaHCO₃组乳腺癌类器官在体外增殖活性显著增强。蛋白质组学分析进一步揭示，NaHCO₃治疗可放大或扰动致癌诱导的蛋白表达变化，涉及细胞-细胞/细胞-基质相互作用、细胞骨架动力学、巨噬细胞趋化与吞噬、PI3K/AKT、Rho GTPases及AMPK等信号通路。


结论指出，口服NaHCO₃疗法在乳腺组织中是一把"双刃剑"：一方面中和肿瘤微环境酸度，另一方面却通过提升净酸外排能力和细胞内pH、加速癌细胞增殖，产生促肿瘤效应，从而抵消了既往报道的抗肿瘤益处。基于此，作者提出相较于缓冲疗法，靶向酸-碱转运蛋白抑制剂可能是更成功的乳腺癌微环境干预策略。该研究为酸性微环境靶向治疗提供了重要的反向证据。


Unisense微电极系统的应用


采用Unisense pH 500玻璃微电极原位测定小鼠乳腺肿瘤微环境pH，操作时先将完成致癌诱导的小鼠麻醉插管后以呼吸机维持呼气末CO₂稳定，将微电极逐步推进至肿瘤不同深度，取各肿瘤的最低pH值作为其微环境pH表征，且仅纳入实验结束时腹腔pH处于7.1~7.7的样本以保证数据可靠性。依托该高空间分辨率检测技术，研究明确证实口服NaHCO₃可将乳腺肿瘤微环境pH从对照组的6.68±0.04显著提升至7.04±0.09，确证了该疗法对肿瘤局部酸性微环境的中和作用，该结果既是验证干预有效性的核心依据，也与后续肿瘤潜伏期、生长负荷及病理特征无组间差异的发现形成关键对照，为“肿瘤微环境碱化的获益被癌细胞适应性变化抵消”的核心结论提供了关键支撑


实验结论


口服NaHCO₃疗法虽能有效中和小鼠乳腺肿瘤微环境的酸性（pH从6.68升至7.04），并通过翻译后修饰增强NBCn1与NHE1介导的净酸外排能力，导致癌细胞稳态 intracellular pH升高，但其并未改善乳腺癌预后——治疗组与对照组的肿瘤中位潜伏期（85.5天vs 82.0天）、肿瘤负荷及组织病理学特征均无显著差异。机制研究表明，这种“无效”源于碱化诱导的代偿性促肿瘤效应。NaHCO₃不仅部分逆转了致癌过程中的氧化磷酸化抑制，为癌细胞提供更优能量代谢基础，更直接促进了乳腺癌类器官的体外增殖；蛋白质组学分析进一步揭示其广泛扰动细胞骨架、细胞-基质互作及免疫相关信号通路。尤为关键的是，净酸外排能力与肿瘤潜伏期呈显著负相关，提示酸外排增强是驱动肿瘤进展的重要因素。

图 1、 口服 NaHCO₃疗法能够使乳腺肿瘤的 pH 值升高，同时增加动脉血和尿液中的[HCO₃⁻]浓度及 pH 值。该疗法还会引发与免疫功能、细胞骨架以及细胞间/细胞与基质之间的相互作用相关的蛋白质表达变化。(A–C) NaHCO₃处理组与对照组小鼠的肿瘤 pH 值(A)、动脉血的 pH 值(B)以及标准[HCO₃⁻]浓度(C)。所有小鼠均接受机械通气治疗，以维持正常血气水平（呼气末 CO₂分数为 3.8%）。(D,E) NaHCO₃处理组与对照组小鼠的尿液 pH 值(D)以及[HCO₃⁻]浓度(E)。(F–H) 与免疫功能、细胞骨架以及细胞间/细胞与基质之间的相互作用相关的蛋白质表达变化。我们将乳腺癌组织与正常组织进行了比较。对照组小鼠的正常乳腺组织（F）、经 NaHCO 3 处理的小鼠与对照组小鼠的乳腺癌组织（G），以及经 NaHCO 3 处理的小鼠与对照组小鼠的正常乳腺组织（H）。

图2、 在接受 NaHCO3 处理的小鼠和对照组小鼠中，无瘤生存期、肿瘤负荷以及乳腺肿瘤的病理学特征均无显著差异。(A) 在诱发乳腺癌后，接受 NaHCO3 处理的小鼠和对照组小鼠的无瘤生存期相似。接受 NaHCO3 处理的小鼠的无瘤生存期中值为 85.5 ± 8.2 天（n=42），而对照组小鼠为 82.0 ± 7.5 天（n=45）。数据通过 Gehan-Breslow-Wilcoxon 检验进行比较。(B) 在首次发现肿瘤后的两周内，接受 NaHCO 3 处理的小鼠和对照组小鼠的肿瘤负荷无显著差异（n=37–41）。与先前的研究结果一致，首次发现的肿瘤大小通常为 3–4 毫米[49]。为使数据更符合正态分布，先对数据进行了对数转换，然后通过非配对双尾 Student’s 检验进行比较。(C) 接受 NaHCO 3 处理的小鼠和对照组小鼠的乳腺肿瘤在各种病理学亚型上的分布情况。(D)来自接受 NaHCO₃处理的小鼠和对照组小鼠的乳腺肿瘤的组化病理学数据、肿瘤负荷以及肿瘤潜伏期的对比图。

图3、在乳腺癌的发生过程中，各种代谢途径都发生了显著紊乱。不过，无论是乳腺癌组织还是正常乳腺组织，其糖酵解代谢过程都不会受到口服 NaHCO₃治疗的影响。(A, B)展示了各代谢途径相关蛋白质的表达变化。我们比较了对照组小鼠的乳腺癌组织与正常乳腺组织的情况(A)，以及接受 NaHCO₃治疗的 mice 的乳腺癌组织与对照组小鼠的情况(B)。p 值是通过 Fisher 右尾精确检验得出的。(C–E)展示了接受 NaHCO₃治疗的 mice 和对照组小鼠的乳腺癌组织及相应正常乳腺组织中葡萄糖(C)和乳酸(D)的浓度，以及相应的[葡萄糖]/[乳酸]比值(E)。

图4、与对照组小鼠相比，接受 NaHCO₃处理的小鼠的正常乳腺组织和乳腺癌组织中，净酸排出能力均有所提高。(A, B) 在对接受 NaHCO₃处理的小鼠以及对照组小鼠的正常乳腺组织(A)和乳腺癌组织(B)进行的实验中，记录了 pH 值的变化情况。实验在有或没有 CO₂/HCO₃⁻的情况下进行。(C) 接受 NaHCO₃处理和未处理的小鼠的癌细胞和正常细胞类器官的细胞内缓冲能力。线性回归分析结果显示，接受 NaHCO₃处理的小鼠与对照组小鼠之间的缓冲能力没有显著差异。(D,E) 从正常乳腺组织(D)和乳腺癌组织(E)中分离出的上皮细胞类器官的净酸排出能力随 pH 值的变化而变化。实验所使用的样本来自接受 NaHCO₃处理的鼠和对照组鼠的组织（每组 n=7）。实验在有或没有 CO₂/HCO₃⁻的情况下进行。数据通过最小二乘线性回归分析进行处理。 (F) 无乳腺肿瘤的存活率与净酸排出能力相关，净酸排出能力以 pH 值来表示，即当净酸排出速度为 14 mM/min 时的 pH 值。pH 值越高，净酸排出能力越强。 (G,H) 从接受 NaHCO₃处理的鼠和对照组鼠中提取的正常乳腺组织及乳腺癌组织的稳态 pH 值分别进行了测量。测量时，pH 值设为 7.4（实心符号）和 6.8（空心符号）。

图5、接受口服 NaHCO₃治疗的鼠类乳腺癌类器官在 pH 值为 6.8 和 7.4 的条件下，其体外增殖活性均有所增加。不过，这种效应仅在存在 CO₂/HCO₃⁻缓冲液的情况下才能被观察到。(A–C)细胞信号传导途径中相关蛋白质的表达情况。p 值是通过 Fisher 右尾精确检验得出的。我们比较了以下组别：对照组小鼠的乳腺癌组织与正常乳腺组织(A)；接受 NaHCO₃治疗的鼠类乳腺癌组织与对照组小鼠的乳腺癌组织(B)；接受 NaHCO₃治疗的鼠类正常乳腺组织与对照组小鼠的正常乳腺组织(C)。(D)使用抗溴脱氧尿苷(BrdU)抗体对乳腺癌类器官进行荧光标记后的原始图像(红色)。细胞核则用 SYTO16 染成绿色。(E, F)在 pH 值为 7.4 和 6 的条件下，接受 NaHCO₃治疗的鼠类乳腺癌类器官与对照组小鼠的乳腺癌类器官的 BrdU 增殖指数(n=7–21)。(E)8（雌性）。BrdU 增殖指数指的是在 6 小时培养后，含有 BrdU 的细胞所占的比例。该指标反映了这一时期内细胞分裂的速率。


结论与展望


酸性肿瘤微环境可改变恶性细胞的行为。本研究探讨了微环境对乳腺癌的影响。研究人员以致癌物诱导的乳腺癌模型为基础，向雌性C57BL/6j小鼠分别提供普通饮用水或含NaHCO₃的饮用水，并在体内检测尿液和血液的酸碱状态、肿瘤代谢（通过微量透析采样）以及肿瘤pH值（使用pH敏感型微电极-unisense）。


基于从乳腺癌组织和正常乳腺组织中新鲜分离的上皮类器官，评估了蛋白质表达（免疫印迹、质谱分析）、细胞内pH值（荧光显微镜）及细胞增殖情况（溴脱氧尿苷掺入法）。口服NaHCO₃治疗使乳腺肿瘤体内的pH值从6.68±0.04升高至7.04±0.09，乳腺上皮类器官的细胞内pH值也上升约0.15。接受NaHCO₃治疗的小鼠乳腺肿瘤中位潜伏期为85.5±8.2天，而对照组为82±7.5天。口服NaHCO₃治疗未影响肿瘤生长、组织病理学特征或糖酵解代谢。经NaHCO₃处理的小鼠细胞净酸排出能力增强，且与乳腺肿瘤潜伏期呈负相关。口服碳酸氢钠治疗可提高乳腺癌类器官的增殖活性。


通过高通量蛋白质组学分析，研究观察到癌变与正常乳腺组织之间以及在口服碳酸氢钠治疗后，蛋白质表达模式的变化，揭示了对代谢、细胞骨架、细胞-细胞及细胞-基质相互作用和细胞信号传导通路的复杂影响。研究结果表明，口服碳酸氢钠治疗可中和乳腺癌微环境，增强细胞净酸外排能力，并促进细胞增殖，而对乳腺癌的发展或肿瘤生长无净效应。


此外，我们还发现口服碳酸氢钠治疗在乳腺组织中产生了一些出人意料的促肿瘤效应，这些效应抵消了此前报道的抗肿瘤作用。本研究采用Unisense pH 微电极原位测定小鼠乳腺肿瘤微环境pH，通过记录电极推进过程中肿瘤不同深度的pH值变化，取每个肿瘤的最低pH作为该瘤体的微环境pH表征。测试的pH数据明确证实了系统性碱化治疗对肿瘤局部酸性微环境的有效中和作用，支撑了"微环境碱化虽实现但被癌细胞适应性增强所抵消"这一核心结论的得出。本研究揭示口服NaHCO₃在乳腺癌模型中是一把“双刃剑”，其提升细胞内pH、加速细胞增殖的促癌作用抵消了微环境碱化的潜在获益，这为酸性微环境靶向治疗提供了重要警示，即相较于全身性缓冲疗法，特异性抑制酸-碱转运蛋白（如NBCn1）可能是更具前景的乳腺癌干预策略。