方法


植物材料


洛贝利亚·多特曼纳和利托雷拉·单叶在夏末至初秋从瑞典西南部的贫营养软水湖泊Värsjö的浅水区采集。采集后不久，我们进行了三个实验。第一，在好氧和缺氧湖水中对分离的叶片和根系加茎进行24小时黑暗呼吸实验。第二，耐受性实验，测量整株植物在好氧或缺氧黑暗水中暴露长达8天后的代谢。第三，存活-恢复实验，测试上述整株植物在好氧或缺氧黑暗水中初始暴露长达8天后24天的植物生长和性能。


好氧和厌氧呼吸


分离的根系加茎和纵向剖开以暴露气腔的叶片，在好氧和缺氧湖水中于20°C恒温培养箱中黑暗孵育24小时。缺氧条件下的组织缺氧通过将植物材料在缺氧湖水中预孵育2小时以达到气体平衡，然后更换缺氧水确保。好氧条件下的组织好氧通过将材料在空气饱和水中孵育，在30 mL密闭瓶中保持O₂浓度在孵育后高于50%饱和度。厌氧呼吸通过溶解无机碳（DIC）随时间的增加来确定，由于呼吸CO₂的释放；好氧呼吸通过CO₂释放和O₂消耗来确定。溶解无机碳通过将少量水样注入酸中，在N₂吹扫的气泡室中测量，携带释放的CO₂进入红外气体分析仪。O₂通过微电极（OX 500；Unisense，丹麦奥胡斯）直接测量。植物组织在105°C干燥24小时，呼吸速率以植物干重（DM）标准化。所有统计评估基于5株植物的重复测量。


黑暗和缺氧耐受性


整株植物在20°C黑暗条件下于好氧和缺氧湖水中孵育1、2、5和8天，暴露后测量其代谢。为确保对好氧或缺氧条件的完全控制，每个物种使用6个1升玻璃瓶（3个对照和3个处理），每个瓶中有5株个体（即每个物种30株植物）。所有瓶子装满过滤湖水。好氧条件通过每天曝气1小时并保留约0.1升空气空间确保。好氧湖水中的O₂浓度始终保持在空气饱和度的80-100%之间。缺氧条件通过N₂吹泡水预孵育2小时、每天N₂吹泡水以及使用完全装满水、无空气空间的玻璃塞瓶实现。每天使用O₂微电极检查完全好氧和完全缺氧条件。


在每个处理时间后，从每个3个重复瓶中收获的每株植物上，在暴露前后测量光合作用、暗呼吸和光系统II最大量子效率。光合作用测量为在350 μmol光子m⁻²s⁻¹（PAR，LiCor 193SA）辐照度和CO₂饱和条件（约1 mM）下2小时孵育的O₂产生，通过将过滤的碱性湖水酸化至所需pH获得。呼吸按上述方法测量，但持续20-24小时。叶片的光合作用和呼吸在纵向剖开以暴露腔的叶片上测量，而茎加根系呼吸在完整根系上测量。最大量子效率在每株植物的成熟叶片上通过荧光产量确定：


Fv/Fm = (Fm - Fo)/Fm


其中Fm为最大荧光产量，Fo为最小荧光产量，Fv为可变荧光产量，使用PEA MK2 Hansatech分析仪（英国）测量。量子效率计算为每株植物5个成熟叶片位置测量值的平均值。统计检验基于3株植物的测量。


存活和恢复


整株植物按上述方法在好氧和缺氧水中孵育1-8天，然后立即测试最大量子效率。通过将每个物种在10个瓶中预孵育（5个保持完全好氧，5个完全缺氧），每瓶5株个体（即每个物种50株植物），实现好氧或缺氧条件的完全控制。为测试预孵育后的活力和恢复，在24天内通过将每株植物单独种植在沉积物芯（15厘米长，6厘米内径的有机玻璃管）中，随机分布在两个大型水族箱中，水族箱装满充气和缓慢混合的湖水，暴露于110 μmol光子m⁻²s⁻¹的16小时光照：8小时黑暗循环中，温度20°C。沉积物从瑞典西南部的Värsjö湖采集，来自自然生长生境，在填充有机玻璃管前仔细混合。为确定新叶的产生和老叶的损失，每株植物最年轻的叶片用毡笔标记一个小黑点。


24天后，确定死亡植物数量以及叶片的形成和损失。然后按上述方法测量叶片光合作用、呼吸和最大量子效率，并确定叶片和根系加茎的干重。统计检验基于好氧和缺氧黑暗条件下1-8天预孵育的5株植物。


统计


使用双因素方差分析评估处理、物种以及叶片与根系加茎的影响。使用Tukey检验进行多重两两比较，使用t检验进行单一两两比较（α = 0.05）。


结果


好氧和厌氧呼吸


在24小时期间测量的好氧呼吸（以O₂消耗计）对于利托雷拉·单叶的叶片和根系加茎显著高于洛贝利亚·多特曼纳（双因素方差分析，Tukey检验，P < 0.05；表1）。以CO₂释放测量的厌氧呼吸对于叶片高于根系加茎，但两种物种之间相似。


厌氧摩尔CO₂释放显著低于好氧摩尔O₂消耗，厌氧与好氧呼吸的相对比例对于洛贝利亚·多特曼纳（叶片0.56；根系加茎0.60）始终高于利托雷拉·单叶（叶片0.39；根系加茎0.36）。在好氧水中，摩尔O₂消耗接近摩尔CO₂释放（0.83-1.0，数据未显示）。


黑暗暴露和恢复后的代谢


两种物种在好氧水中黑暗8天后代谢完全活跃，对于存活个体，在缺氧水中5天后也如此（图1）。两种物种的最大量子效率（Fv/Fm）在缺氧黑暗孵育后立即显著低于好氧水，并随处理时间延长而下降（双因素方差分析，Tukey检验，P < 0.05）。缺氧8天后，两种物种的量子效率与仅暴露1或2天相比显著下降。24天恢复后，两种物种在所有处理中的量子效率显著增加，与好氧处理中的量子效率无显著差异。

两种物种存活植物在24天恢复后测量的光合作用，在暴露于8天缺氧的植物中与保持在好氧条件下的植物无显著差异（图1；双因素方差分析，Tukey检验，P > 0.05）。恢复后的光合作用在两种物种之间也无显著差异。


好氧呼吸对于两种物种在缺氧或好氧水中预孵育长达8天或24天恢复后均无显著变化（图1）。总体而言，利托雷拉·单叶的呼吸显著高于（1.25-1.6倍）洛贝利亚·多特曼纳（图1，t检验，P < 0.05，自由度=117；表1，双因素方差分析，Tukey检验，P < 0.05）。