细胞


研究了人结肠直肠腺癌细胞（HT-29细胞，ATCC编号HTB38）、人胚胎肾细胞（HEK-293细胞，ATCC编号CRL1573）和转染人胚胎肾细胞（Flp-In-293，来自Thermo Fisher Scientific Inc.）的pHe。细胞在补充有10%胎牛血清和青霉素-链霉素（100 IU/mL-0.1 mg/mL）的Dulbecco改良Eagle培养基中生长。细胞以2.25×10⁵细胞/mL的浓度接种在直径3.5厘米的塑料培养皿（Nunc，Thermo Fisher Scientific）上，并在37°C、5%CO₂加湿培养箱（MCO-20AIC Sanyo，日本）中生长至汇合。所有培养基和补充剂均从Thermo Fisher Scientific Inc.和Sigma-Aldrich, Inc.购买。在将细胞培养基更换为预热的pH 7.4 Ringer缓冲液（含130 mM NaCl、5 mM KCl、0.9 mM CaCl₂、1.2 mM MgCl₂、15 mM NaH₂PO₄·2H₂O和5 mM葡萄糖）后约20分钟，研究汇合细胞的pHe。在细胞外空间记录pHe值，时间不超过85分钟。所有实验中使用生长至100%汇合的细胞，以避免在没有细胞的位置进行测量（因为实验未通过光学显微镜观察）。


pH微电极的制备和校准


首先制备碳纤维微电极，然后用还原氧化石墨烯和丁香醛嗪修饰。微电极通过将碳纤维封装到玻璃微吸管的锥形端来制备，玻璃微吸管使用Sutter Instruments, Inc.（美国）的P-97拉制器拉制玻璃毛细管获得。以这种方式制备的微电极首先在EG-401微磨机（Narishige Group，日本）上机械抛光，然后电化学清洁（在0.5 M H₂SO₄中，+2V下30秒，-1V下10秒，以及0 V到+1V之间25个循环，扫描速率为0.1 V/s）。本工作中使用的碳纤维微电极具有直径37微米的电化学活性盘，Rg因子在2到3.3之间（Rg因子是电极半径与电化学活性盘半径之比）。


为了用还原氧化石墨烯和丁香醛嗪修饰，将此类碳纤维微电极浸入4 mg/mL氧化石墨烯水溶液中4-5次（每次浸入之间晾干），然后浸入0.85 mg/mL丁香醛嗪乙醇溶液中3次（每次浸入之间晾干）。然后通过在0 V到-0.9V之间进行10个电位循环（扫描速率0.01 V/s），将吸附在微电极上的氧化石墨烯电化学还原。用还原氧化石墨烯和丁香醛嗪修饰的微电极产生循环伏安图，具有一对电流峰，对应于丁香醛嗪的电氧化和电还原。这两个电流峰的峰电位被发现依赖于修饰微电极所浸入溶液的pH。因此，这两个电流峰促进了丁香醛嗪修饰微电极作为伏安pH微电极的使用。在使用给定pH微电极进行细胞水平实验之前，总是使用6种具有生物相关pH值的溶液进行校准。所有电化学实验均使用Metrohm Autolab BV（荷兰）的PGSTAT128N恒电位仪和三电极体系进行，参比电极为Ag/AgCl（3 M KCl），对电极为Metrohm AG（瑞士）的玻璃碳电极。本工作中提及的所有电位均相对于此Ag/AgCl（3 M KCl）参比电极。


pH微电极在细胞外空间中的使用


使用Sensolytics GmbH（德国）的扫描电化学显微镜（SECM）将pH微电极可重复地定位在细胞外空间中。对于垂直方向的定位，将微电极极化至-0.550V（发生氧还原的电位），然后缓慢降低，直到细胞覆盖的表面开始阻止氧气进入微电极的电化学活性区域。当氧还原反应给出的电流降至本体溶液中其值的80%时，总是停止将微电极向细胞降低。然后，在该距离处记录循环伏安图，并用于计算细胞附近的pHe（pHclose）。接下来，将pH微电极提升500微米，并记录另一个循环伏安图。该伏安图用于计算远离细胞的pHe（pHfar）。两个pHe值用于计算表征汇合细胞单层在相应位置中的pH梯度（pHfar - pHclose）。以类似方式在每个细胞单层（培养皿）的7-8个位置测量pH梯度。每种细胞类型至少研究了7个细胞单层（培养皿）。每个细胞单层位置中询问的细胞数量估计在4到6之间（通过将开发的pH微电极的尺寸与研究细胞的尺寸进行比较）。


结果与讨论


pH微电极的原理及石墨烯在pH微电极中的作用


丁香醛嗪不溶于水。因此，一旦丁香醛嗪从乙醇溶液中吸附到碳纤维微电极表面，只要微电极在水溶液中使用，它就不会从那里脱附。丁香醛嗪也相对容易电化学氧化和还原。因此，丁香醛嗪修饰电极的循环伏安图在254±8 mV处显示阳极电流峰（由于丁香醛嗪的氧化），在198±9 mV处显示阴极电流峰（由于丁香醛嗪的还原）（在pH 7.36±0.04时）。此外，丁香醛嗪的电化学过程涉及两个质子以及两个电子。这两个质子使丁香醛嗪的电化学具有pH敏感性。在循环伏安法中，这种pH敏感性表现为当pH降低时电流峰向更正电位的移动。因此，丁香醛嗪修饰电极和吸附丁香醛嗪的形式电位（计算为阳极和阴极峰电位的平均值）可用于确定浸入电极的溶液的pH。


最初制备了带有丁香醛嗪但不含石墨烯的pH微电极。此类pH微电极的循环伏安图特征为两个小的、通常 poorly defined 的电流峰，由于吸附的丁香醛嗪的氧化和还原。接下来，由于有大量文献关于石墨烯对电化学传感器的有益影响，制备了带有丁香醛嗪和还原氧化石墨烯的pH微电极。此类微电极的循环伏安图显示，还原氧化石墨烯增加了丁香醛嗪氧化和还原给出的电流峰的振幅（见图1），最可能是通过增加微电极的电化学活性表面积。更大、形状更好的峰使峰电位的读取更容易、更精确。还原氧化石墨烯还将峰电位差从18±1增加到36±8 mV。然而，它对半峰宽的总宽度（从81±1增加到86±4 mV）和电流峰比值（从0.96±0.03增加到0.99±0.04）仅有轻微影响。尽管还原氧化石墨烯引起了这些微小变化，伏安图仍然保持表面吸附、准可逆氧化还原对的特征。

图1有或无还原氧化石墨烯修饰的丁香醛嗪电极的循环伏安图。实验条件：使用pH 7.28的Ringer缓冲液作为支持电解质；电位扫描速率为20 mV/s。