摘要


目前仅有少数工具适合以高空间分辨率测量贴壁生长哺乳动物细胞的细胞外pH，且这些工具均未被全球实验室广泛使用。细胞生物学家通常仅限于使用市售荧光探针测量细胞内pH。因此，我们构建了一种伏安pH微电极，并研究了其监测贴壁生长哺乳动物细胞细胞外pH的适用性。该伏安pH微电极由直径37微米的碳纤维微电极经还原氧化石墨烯和丁香醛嗪修饰而成。氧化石墨烯用于增加传感器的电化学活性表面积，而丁香醛嗪则通过其pH依赖的电化学氧化和还原促进pH传感。所构建的伏安pH传感器具有良好的灵敏度（60±2.5 mV/pH单位）、重现性（使用5个不同微电极测量相同pH的变异系数≤3%）和稳定性（3小时内pH漂移约0.05单位），这些特性被成功用于研究癌细胞和正常细胞的细胞外空间酸化。结果表明，所开发的pH微电极以及基于扫描电化学显微镜完善的实验方案，能够揭示缺乏空间分辨率或无法在细胞外空间中可重复定位的pH传感器无法获得的细胞pH调节细节。


为什么测量哺乳动物细胞的细胞外pH（pHe）很重要？为什么以高空间分辨率测量pHe也是可取的？回答第一个问题，只需提及癌细胞调节其pH的方式与正常细胞不同。通过少数独特机制，它们即使在pHe低至6.5时也能维持中性细胞内pH。这种能力在开发抗癌药物（可终止该能力）或药物递送和癌症成像解决方案（有益地利用该能力）时被深入研究。回答第二个问题，只需提及肿瘤常因同一肿瘤内癌细胞的异质性而在化疗中存活。尽管某种疗法杀死肿瘤内的大多数癌细胞，但仍有少数细胞足够不同而存活并引起进一步问题。当使用从数百万细胞读取平均信号的分析工具研究细胞时，这种癌细胞的异质性被完全忽视，相关信息丢失。要加以考虑，这种异质性需要具有良好（理想情况下单细胞）空间分辨率的分析工具。除癌症外，还有其他几种病理状态中细胞的pH调节受到干扰（例如许多神经系统疾病）。在细胞水平上研究这些病理状态也可受益于能够测量pHe的工具。


然而，目前仅有少数工具适合以高空间分辨率测量贴壁生长哺乳动物细胞的pHe，且这些工具都不完美或未被全球实验室广泛使用。最近描述了一种非常有前景的荧光pH探针。该探针通过将pH敏感荧光染料连接到pH低插入肽（pHLIP）上获得，可以用pH敏感荧光染料装饰细胞外表面。该探针报告癌细胞表面的pH值低至6.0（即比本体pH低1.4个pH单位）。然而，这种方法存在荧光方法的固有问题（例如猝灭和光漂白）。


电化学微电极也被开发用于高空间分辨率测量pH。重要的是要提及，与需要将染料添加到细胞上的荧光方法不同，电化学pH微电极有利地以自然状态研究细胞。大多数这些pH微电极分为三类：（i）玻璃基微电极，（ii）离子载体基微电极，和（iii）金属氧化物基微电极。然而，其中只有少数被用于测量细胞的pHe，更少用于测量哺乳动物细胞的pHe。


电位微电极（使用质子选择性玻璃或液体离子载体制成）被用于测量贴壁生长的巨噬细胞和破骨细胞下方的pH。在破骨细胞与培养皿底部之间的附着区测量到pH值低至3。最近，通过将市售质子离子载体装入玻璃微吸管构建了一种电位pH微电极，用于测量细菌生物膜附近的pH。pH不仅在生物膜上方评估，还在数百微米厚的细菌生物膜内部评估。玻璃pH微电极或基于氧化铱的电位pH微电极被用于此目的。还开发了平面、芯片上、金属氧化物pH微电极，用于观察在其旁边（或全部覆盖）贴壁生长的细胞的pHe。用于扫描离子电导显微镜的玻璃纳米吸管也增强了pH传感能力。然而，所得的pH传感器尚未用于研究pHe。


电位、玻璃基或离子载体基pH微电极非常脆弱，且响应时间相对较长。要在细胞外空间中使用，它们不仅需要电化学仪器，还需要光学显微镜（因为其相对于细胞的定位是在目视观察下完成的）。这使得测量pHe的实验装置相对复杂。带有液体离子载体膜的pH微电极的寿命也有些有限，因为离子载体会从微电极中泄漏。平面、芯片上、金属氧化物pH微电极消除了这些缺点中的几个。然而，这种pH微电极相对于细胞的位置控制不佳，且在实验过程中无法更改。


本研究表明，基于还原氧化石墨烯和丁香醛嗪的pH微电极可用于可靠地测量pHe，具有良好的空间分辨率，能够捕捉细胞异质性，并揭示癌细胞与正常细胞之间的差异。与可能最相似的工作相比，本研究提出的不是电位而是伏安pH微电极，并研究哺乳动物细胞而非细菌的pHe（而哺乳动物细胞构建的pH梯度小于细菌生物膜）。基于丁香醛嗪的伏安pH纳米传感器的使用已有报道。然而，用还原氧化石墨烯增强基于丁香醛嗪的pH传感器以及新型还原氧化石墨烯和丁香醛嗪基pH传感器在细胞水平上的首次使用在此描述。


实验部分


材料


使用C3005碳纤维（World Precision Instruments，美国）、EPO-TEK 302-3M环氧树脂（Epoxy Technology Inc.，美国）和硼硅酸盐玻璃毛细管（1.5 mm外径×0.86 mm内径，Harvard Apparatus Ltd.，英国）构建碳纤维微电极。使用氧化石墨烯（Graphenea，西班牙）和丁香醛嗪（Sigma-Aldrich Inc.，美国）将这些微电极转变为pH微电极。使用Ringer溶液（由NaCl、KCl、CaCl₂和葡萄糖（Sigma-Aldrich Inc.）、MgCl₂（Chimopar SA，罗马尼亚）和NaH₂PO₄·2H₂O（Carl Roth GmbH，德国）配制）进行传感器校准实验和细胞水平实验。


所有水溶液均使用Direct-Q 3UV水纯化系统（Millipore）制备的超纯水。